鄭 敏，彭敬東，吳傳隆，王 寧

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715）

近年來，高效液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜（HPLCMS/MS）聯(lián)用已發(fā)展成為科研和日常分析中最有力的一種工具，在各種應(yīng)用領(lǐng)域中都有廣泛的應(yīng)用[1]。隨著新的電離方法，尤其是電噴霧電離源（ESI）的出現(xiàn)，HPLC－MS/MS法更牢牢確立了其在研究中的重要地位。電噴霧電離源的一級質(zhì)譜中，分子離子峰豐度高，干擾?。浑妵婌F電離源的電離效率高，足以滿足多級質(zhì)譜離子或化合物斷鍵的需要；同時，解析分子離子的同位素峰也可確定離子帶電數(shù)和相對分子質(zhì)量，可使質(zhì)量分析器檢測的質(zhì)量提高幾十倍甚至上百倍；加之ESI可以很方便地與液相色譜分離技術(shù)連接，通過調(diào)節(jié)液相分離條件和調(diào)整控制電壓離子源，就能很容易地使得離子斷裂，獲取結(jié)構(gòu)信息。將液相色譜的高分離特性和質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性結(jié)合，可以簡化樣品的前處理，提供未知樣品的結(jié)構(gòu)和質(zhì)量數(shù)據(jù)，縮短分析時間[2－8]。同時，質(zhì)譜的強(qiáng)定性能力不再因HPLC常用的檢測手段——紫外或熒光檢測器要求底物必須具備生色團(tuán)而受到限制，HPLC－MS這一技術(shù)必將得到廣泛的應(yīng)用。

小分子的脯氨酸催化劑，現(xiàn)在仍然是很適用的有機(jī)催化劑[9－10]。無論在經(jīng)濟(jì)成本和簡單實(shí)用方面，它都是其他很多有機(jī)催化劑無法比擬的。然而，未經(jīng)修改的脯氨酸有一個致命的缺點(diǎn)，即自身缺乏疏水基團(tuán)，同時還不含生色團(tuán)，其催化合成的對應(yīng)異構(gòu)體多需要在非極性環(huán)境下生成。因?yàn)楹玫膶τ丑w的誘導(dǎo)很難或者不可能在水介質(zhì)中發(fā)生[10，11－13]，因此無論是給脯氨酸鍵合上必要的疏水基，還是脯氨酸的脫保護(hù)過程，都是復(fù)雜、耗時的，鑒定也是很難進(jìn)行的。本工作采用Kristensen等[10]建立的方法，直接通過CF3CO2H羥酰化這一步選擇性的在脯氨酸的間位引入非極性基團(tuán)，合成得到兩個O－?；苌稃}酸鹽結(jié)晶物。

已有許多文獻(xiàn)報(bào)道了HPLC－MS/MS法的有價值的應(yīng)用，科學(xué)家們對液質(zhì)聯(lián)用的興致也提高了很多[14－15]。然而，目前卻只有很少的研究報(bào)道了高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜在線監(jiān)測反應(yīng)的定性分析。本工作為了通過高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜的快速分離和高靈敏度、強(qiáng)定性的功能找到最佳的合成反應(yīng)條件，通過正交水平因素法研究各條件對反應(yīng)的影響強(qiáng)弱，以更好的控制反應(yīng)。兩個缺乏生色團(tuán)的O－酰基－4－羥基脯氨酸鹽酸鹽有機(jī)催化劑在優(yōu)化好的反應(yīng)條件下進(jìn)行合成。通過液質(zhì)聯(lián)用能有效地監(jiān)控這兩個O－?；词剑?－羥基脯氨酸鹽酸鹽有機(jī)催化劑的合成，并對產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，從而解釋反應(yīng)機(jī)理，拓展HPLC－MS的應(yīng)用范圍。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Agilent 1200高效液相色譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品，配有Agilent化學(xué)工作站系統(tǒng)軟件；Bruker核磁共振儀（300M，NMR），Bruker Daltonics HCT質(zhì)譜儀（配有Bruker工作站）：美國Bruker公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

O－4－羥基脯氨酸和酰氯（分析純）：美國Sigma公司產(chǎn)品；CF3CO2H，乙醚和甲酸（分析純）：成都科龍化工廠產(chǎn)品；乙腈和甲醇（色譜純）：美國Scharlau化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；CDCl3：青島龍微波技術(shù)有限公司產(chǎn)品；水為去離子水；其他試劑均為分析純或更高純度。

1.3 脯氨酸有機(jī)催化劑的合成

將120mL CF3CO2H加入干燥潔凈的500 mL圓底燒瓶中，并放在冰浴中。32.75g（250 mmol）粉狀羥基脯氨酸在70～75℃下干燥24h后，緩慢加入反應(yīng)瓶中，劇烈攪拌，形成粘性溶液（脯氨酸有小部分沒有溶解）?；旌衔锓磻?yīng)15 min后，從冰浴中取出，室溫?cái)嚢?min，將1.5倍摩爾比的酰氯緩慢加入反應(yīng)瓶中，室溫下繼續(xù)攪拌6h，得到無色透明溶液[13，16－18]。吸取 100 μL反應(yīng)液加入900μL乙腈稀釋，取5μL反應(yīng)稀釋液通過高效液相自動進(jìn)樣，分離。對產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)進(jìn)行質(zhì)譜測定。

將反應(yīng)6h后的反應(yīng)燒瓶放在冰浴中冷卻，劇烈攪拌20min后，加入360mL乙醚，先緩慢、后加快速度。產(chǎn)生的白色懸浮液在0～5℃下攪拌15min后，減壓過濾。乙醚潤洗2次，通風(fēng)櫥內(nèi)室溫干燥23h，得到干燥的細(xì)白粉末狀的O－?；?－羥基脯氨酸鹽。經(jīng)此方法洗滌的樣品純度較高，可直接進(jìn)行核磁分析，反應(yīng)機(jī)理示于圖1。

圖1 脯氨酸有機(jī)催化劑的反應(yīng)機(jī)理Fig.1 The mechanism of the reaction

1.4 LC/MS條件

1.4.1 色譜條件 采用自動進(jìn)樣器進(jìn)樣；色譜柱：Gemini－C18柱（150×4.6mm×5mm）；進(jìn)樣量：5mL；柱溫：30℃；流動相為V（乙腈）∶V（5mmol/L甲酸溶液）＝40∶60）的混合溶液；流速0.2mL/min；運(yùn)行時間15min。

1.4.2 質(zhì)譜條件 毛細(xì)管電壓3 500V，噴霧器25MPa，干燥氣體流速10L/min，干燥氣體溫度350℃，質(zhì)譜掃描范圍m/z 15～1 000。串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

表1 分析物串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Tandem mass spectrometry parameters for the targets

2 結(jié)果與討論

2.1 通過正交試驗(yàn)優(yōu)化脯氨酸有機(jī)催化劑的合成

為了找到合成脯氨酸有機(jī)催化劑的最佳條件，應(yīng)用水平正交試驗(yàn)，這不僅可以研究獨(dú)立變量對反應(yīng)的影響，也可以確定每一個因素對反應(yīng)影響的強(qiáng)弱關(guān)系[19－20]。

試驗(yàn)中，根據(jù)反應(yīng)時間（A），底物摩爾比（B）和溫度（C）3個因素對反應(yīng)效率的影響，設(shè)定了3因素6水平的正交試驗(yàn)。在測定結(jié)果中，k是O－?；词剑?－羥基脯氨酸的分子離子峰面積的總和，結(jié)果列于表2。通過比較各水平的k值，可以確定反應(yīng)的最佳條件。R＝max｛k1，k2，…，kn｝－min｛k1，k2，，…kn｝，R 代表各因素對反應(yīng)的影響。高R值的變量，意味著這個變量對結(jié)果的影響更強(qiáng)，結(jié)果列于表3。

分析結(jié)果得到合成的最佳反應(yīng)條件為A2B4C5，各因素對反應(yīng)的強(qiáng)弱影響為：C＞B＞A。因此，將1.5倍摩爾比的酰氯加入反－4－羥基脯氨酸中，讓它們在室溫下反應(yīng)6h，即為合成的最佳條件。

表2 正交試驗(yàn)因素表Table 2 Orthogonal factors

表3 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與直觀分析結(jié)果（n＝3）Table 3 Experimental arrangement and results of activity of reaction time，mole ratio of substrates and temperature（n＝3）

2.2 合成的脯氨酸有機(jī)催化劑分子的分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)測定

MS/MS是在分子質(zhì)量和物質(zhì)結(jié)構(gòu)驗(yàn)證方面有用的工具之一。質(zhì)譜作為結(jié)構(gòu)的重要儀器，同時具備了準(zhǔn)確、快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)。O－?；?－羥基脯氨酸苯乙烯和O－?；?－羥基脯氨酸戊烷的結(jié)構(gòu)分別示于圖2，圖3。二者的質(zhì)譜圖分別示于圖4，圖5。

M1（O－酰基－4－羥基脯氨酸苯乙烯）：

MS：＋MS：圖3b中，283.5 [M＋Na]，261.5[M＋1]；

MS2：圖3c中，243.3[M－H2O]，215.3[M－COOH]，130.5[M－O－?；?－羥基脯氨酸]＋。圖3c中的碎片質(zhì)量同圖3d中斷鍵部位的質(zhì)量片段完全成一一對應(yīng)關(guān)系。以上數(shù)據(jù)充分證明了圖3a中1號出峰物即為O－?；?－羥基脯氨酸苯乙烯。

圖2 O－?；?－羥基脯氨酸苯乙烯的結(jié)構(gòu)圖Fig.2 The structure of O－acyl－trans－4－h(huán)ydroxy－proline hydrochloridel styrene

圖3 O－?；?－羥基脯氨酸苯乙烯的質(zhì)譜圖Fig.3 MS of O－acyl－trans－4－h(huán)ydroxy－proline hydrochloridel styrene

圖4 O－?；?－羥基脯氨酸戊烷的結(jié)構(gòu)圖Fig.4 The structure of O－acyl－trans－4－h(huán)ydroxy－proline hydrochloridel pentane

M2（O－?；?－羥基脯氨酸戊烷）：

MS：＋MS：251.5[M＋Na]，229.5[M＋1]；

MS2：183.5[M－COOH]，131.5[O－?；词剑?－羥基脯氨酸]＋。這些質(zhì)譜數(shù)據(jù)亦能充分證明圖5a中2號出峰物即為O－?；?－羥基脯氨酸戊烷。

脯氨酸有機(jī)催化劑在二級質(zhì)譜中的斷鍵過程示于圖6。

圖5 O－?；?－羥基脯氨酸戊烷的質(zhì)譜圖Fig.5 MS of O－acyl－trans－4－h(huán)ydroxy－proline hydrochloridel pentane

為了使測定的結(jié)果更加可信，采用核磁共振法來驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中合成的材料結(jié)構(gòu)。

O－酰基－4－羥基脯氨酸苯乙烯：

圖6 脯氨酸有機(jī)催化劑在二級質(zhì)譜中的斷鍵過程Fig.6 The bond breaking process of proline organic catalyst in the secondary mass

O－?；?－羥基脯氨酸戊烷：

通過以上質(zhì)譜譜圖、數(shù)據(jù)同氫譜（1HNMR）以及碳譜（13C）提供的信息對比分析，表明試驗(yàn)所得的產(chǎn)品即為需要的脯氨酸有機(jī)催化劑。質(zhì)譜分析結(jié)果也能充分證明物質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)，液質(zhì)聯(lián)用的結(jié)構(gòu)分析準(zhǔn)確、靈敏，方法快速、經(jīng)濟(jì)。

2.3 優(yōu)化色譜分離

甲酸濃度對色譜分離有較大的影響。配制了一系列濃度分別為1、2、4、5、7、10mmol/L的甲酸溶液進(jìn)行了研究。結(jié)果表現(xiàn)，當(dāng)甲酸濃度為5mmol/L，可以實(shí)現(xiàn)最好的色譜分離。這種現(xiàn)象可以認(rèn)為色譜分離的目標(biāo)底物自身是一種弱酸性物質(zhì)。此外，甲酸還可以增強(qiáng)底物在質(zhì)譜中的電離能力，對試驗(yàn)是非常有幫助的。因此，試驗(yàn)采用5mmol/L甲酸水溶液作為流動相的水相。

3 結(jié)論

兩個O－?；?－羥基脯氨酸有機(jī)催化劑在高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法建立的正交試驗(yàn)優(yōu)化條件下進(jìn)行了合成。高效液相色譜法的快速高效分離，MS/MS對產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)的高靈敏度和高選擇性的檢測鑒定，為實(shí)驗(yàn)研究節(jié)約了大量時間。正交試驗(yàn)試驗(yàn)了各因素對反應(yīng)效率的影響，表明了各因素對反應(yīng)影響強(qiáng)度的強(qiáng)弱，也為試驗(yàn)找到了最佳的反應(yīng)條件：將1.5倍摩爾比的酰氯加入反－4－羥基脯氨酸中，在室溫下反應(yīng)6h。同時，高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法能快速、準(zhǔn)確地鑒定產(chǎn)物及其純度，并對反應(yīng)機(jī)理做進(jìn)一步解釋。該方法簡便、易行，是一種省時、經(jīng)濟(jì)、有效的研究方法和分析手段，可用于有機(jī)反應(yīng)監(jiān)控和產(chǎn)物分析，也是高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜應(yīng)用的拓展。

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