高 照，張亦農(nóng)

（國家體育總局中國反興奮劑中心，北京 100029）

抗凝血藥物是國際馬術聯(lián)合會（International Equestrian Federation，F(xiàn)EI）禁用藥物名錄中的一類藥物[1]，由于香豆素類及茚酮類抗凝血藥物具有生物活性且廣泛存在于天然產(chǎn)物中，近年來有關該類物質的臨床應用和毒性引起了人們的普遍關注。歐洲食品安全局在對動物肝中毒實驗的非顯著性不良效應水平研究基礎上，規(guī)定了人每日可承受的最大攝入量為0.07 mg/kg[2]。目前針對該類藥物主要采用液相色譜法進行藥物毒理和體內代謝方面的研究，對幾種藥物，尤其是雙香豆素和苯茚二酮類的液相色譜－質譜（LC－MS/MS）測定方法的研究較少[3－4]。HPLC－MS/MS法靈敏度高、專屬性和特異性好，是近年來興奮劑檢測方法主要的發(fā)展方向[5]。本實驗通過固相萃取凈化等手段純化和富集樣品，運用HPLC－MS/MS進行快速分析和篩查，并對該類化合物的電噴霧離子化裂解途徑進行歸納，建立能夠同時快速篩查和定量測定飼料中該類藥物的方法。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Agilent 6410LC－MS/MS系統(tǒng)（1200binary快速液相，6410/2k－A三重四極桿質譜儀）：美國Agilent公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機：美國Sigma公司產(chǎn)品；渦旋振蕩器：Scientific Industry公司產(chǎn)品；固相萃取裝置：美國 Waters公司產(chǎn)品；Milli－Q純水系統(tǒng)：美國Millipore公司產(chǎn)品。

雙香豆素（dicoumarin）和雌三醇（IS）：購自中國藥品生物制品檢定所；醋硝香豆素（acenocoumarin）、苯茚二酮（phenidione）、芐丙酮香豆素（warfarin）、香豆素（coumarin）：均購自上海安譜科學儀器有限公司。雙香豆素使用氯仿溶解，其他標準品使用甲醇溶解，各配制1g/L標準儲備液，分別用甲醇稀釋標準儲備液制備系列標準工作液。甲醇、乙腈、乙酸乙酯（色譜純）：均購自沃凱公司；氯仿、高氯酸（分析純）：購自北京試劑公司；乙酸胺（色譜純）：購自Baker公司；MCX固相萃取柱（150mg）：美國 Waters公司產(chǎn)品。

1.2 儀器實驗條件

1.2.1 色譜及質譜條件 色譜柱：Zorbax SB C18柱（2.1mm×100mm×3.5μm）；柱溫30℃；流速2.5mL/min；流動相 A：10mmol/L乙酸銨水溶液；流動相B：乙腈溶液；干燥氣溫度320℃；干燥氣流速12L/min；霧化器壓力2.794×105Pa；毛細管電壓：3 500V（＋）/3 000V（－）；流動相梯度為：0～2min、20%B，2～10 min、20～28%B，10～10.01min、28%～90%B；10.01～15min，90%B；Post run：6min；進樣量10μL。5種藥物及內標MRM優(yōu)化的采集參數(shù)列于表1。

表1 MRM檢測模式下5種藥物優(yōu)化的質譜條件Table 1 The optimized conditions of MRM detection for five anticoagulants

1.2.2 樣品預處理 精確稱量（1.00±0.02）g經(jīng)粉碎的飼料于50mL具塞離心管中，加入100 μL 1μg/L雌三醇內標，靜置1h后準確加入4.0mL甲醇，渦旋振蕩2min后超聲20min，然后以9 000r/min冷凍（－4℃下）離心10min，吸取上清液于另一50mL離心管中，再向殘渣中加入16mL 0.02mol/mL NaOH 溶液，渦旋振蕩5min后，相同條件下冷凍離心，合并2次提取溶液后加入40μL高氯酸溶液調節(jié)pH 4，渦旋振蕩2min后以4 000r/min離心5min。上清液通過Oasis MCX（150mg/6mL）萃取小柱（依次用6mL甲醇、6mL水活化）凈化，離心管底層白色膠狀蛋白沉淀用1mL甲醇、5mL水洗滌后，離心后一同過柱。5mL 15%甲醇水淋洗后，20mm Hg負壓下抽干3min，用5mL V（氯仿）∶V（異丙醇）＝5∶1的混合溶液洗脫。收集洗脫液于50℃下氮氣吹干，用400μL V（甲醇）∶V（水）＝1∶1的混合溶液溶解后檢測。5種物質定量下限及內標提取離子色譜圖示于圖1。

圖1 5種物質定量下限及內標的提取離子色譜圖Fig.1 The extracted ion chromatography of all drugs at the level of lower limit of quantification

2 結果與討論

2.1 質譜色譜條件優(yōu)化及稀釋溶劑的選擇

實驗選用Zorbax SB C18色譜柱（2.1mm×100mm×3.5μm），5種藥物有較好的靈敏度和分離度，且相互間無明顯干擾。根據(jù)香豆素類藥物及茚二酮類藥物的理化性質和結構特征，分別在正負模式下考察了5種藥物的質譜響應，結果發(fā)現(xiàn)香豆素在正離子模式下一級全掃描均有較好的響應，主要為準子離子峰[M＋H]＋，另外有較弱的[M＋Na]＋峰。其余的藥物均為在負離子模式下有較好的響應，主要為準分子離子峰[M－H]－。選擇性質較為相似的雌激素雌三醇[6]作為內標。通過對不同碰撞能量下主要碎片離子的分析，對5種藥物的裂解途徑進行解析，所選擇的主要離子與其結構特征相符，保證了該類物質定性分析的準確性。每個待測物選取兩對豐度較大、基質干擾小的離子對作為定量離子對和輔助定性離子對，采集分為5段，分別采用正負切換的離子掃描模式，各時間段內通過優(yōu)化駐留時間保證定性定量的準確度，使待測物選擇離子色譜峰上采集點不少于20個。實驗比較了甲醇，甲醇水溶液（V（甲醇）∶V（水）＝1∶1），乙腈水溶液（V（乙腈）∶V（水）＝1∶1）作為復溶溶劑進樣，結果表明，用甲醇水溶液（V（甲醇）∶V（水）＝1∶1）定容后，上樣各藥物峰型較好且響應良好。

2.2 樣品預處理方法的優(yōu)化

目前針對幾類藥物的提取方法多采用加入酸性緩沖液后，用乙酸乙酯、氯仿等有機溶劑液液萃取[7－11]后濃縮進樣，但賽馬飼料為植物性復合飼料，基質較為復雜[12]，故選擇固相萃取提取凈化。有文獻報道Yu[13－14]等用反相混合型陽離子交換固相萃取柱對沉淀蛋白后賽馬血液中的違禁藥物進行了提取凈化，以V（二氯甲烷）∶V（乙酸乙酯）＝4∶1的混合溶液洗脫中性和酸性藥物，以含2%濃氨水的V（乙酸乙酯）∶V（二氯甲烷）∶V（異丙醇）＝5∶4∶1的混合溶液洗脫堿性藥物，結果有較好的靈敏度和重現(xiàn)性?；诨衔锏男再|（香豆素類藥物極微溶于醇和醚試劑，略溶于氯仿，而香豆素及茚二酮類在堿性溶液中易溶），實驗了滲透組織能力較好的甲醇浸潤和沉淀蛋白后用0.02mol/LNaOH溶液提取5種藥物后，提取上清液經(jīng)陰離子交換混裝柱Oasis MAX凈化后，以2%甲酸乙腈溶液洗脫，結果表明，凈化后雙香豆素和芐丙酮香豆素的回收率均較低且波動較大，這可能是由于香豆素類物質在堿性環(huán)境下過柱時間較長發(fā)生不可逆開環(huán)，部分待測物降解造成的。在相同條件下提取上清液，用HClO4調pH值至弱酸性后，分別通過陽離子交換混裝柱Oasis MCX及Oasis HLB萃取柱凈化，結果顯示固相萃取柱HLB凈化后基質干擾較多；MCX萃取柱凈化后用V（氯仿）∶V（異丙醇）＝5∶1溶液洗脫，5種藥物的回收率及重現(xiàn)性較好，空白提取樣品中相同時間不出現(xiàn)與標準物質提取離子峰干擾的雜質峰，凈化專屬性較強，且省去了有機試劑提取液過萃取柱凈化前的濃縮過程，故采用MCX萃取柱凈化，具體見1.2.2樣品預處理。

2.3 定量方法的建立

2.3.1 標準工作曲線及檢出限 準確稱量6份（1.00±0.02）g空白飼料于50mL具塞離心管中，加入100μL 1mg/L內標試劑雌三醇試劑后，分別添加系列標準工作液制備醋硝香豆素，香豆素的質量濃度分別為10、20、40、100、200、500ng/g；芐丙酮香豆素，雙香豆素的質量濃度為20、40、80、200、500、800ng/g；苯茚二酮的質量濃度為40、80、200、400、800、1 000ng/g的基質加標樣品。靜置1h后按1.2.2項進行批處理，以飼料樣品中添加待測物濃度為橫坐標，待測物與內標物的提取定量離子色譜峰面積比值為縱坐標進行回歸運算得到標準工作曲線，列于表2。制備系列質量濃度空白加標樣品經(jīng)預處理后連續(xù)進樣，為保證定性定量的準確性，以不低于10倍信噪比（S/N≥10）對應的基質添加濃度作為方法的檢出限，以不低于20倍信噪比（S/N≥20）對應的基質添加濃度作為方法的定量限，最終確定苯茚二酮的檢出限為15ng/g，定量限為40ng/g；香豆素和醋硝香豆素的檢出限為4ng/g，定量限為10ng/g；華法林和雙香豆素的檢出限為10ng/g，定量限為20ng/g；5種物質定量下限及內標物提取離子色譜圖示于圖1。

表2 5種藥物的工作曲線，相關系數(shù)和定量下限Table 2 Linear range，correlation coefficient of calibration curves and LOQ of five drugs

2.3.2 方法的回收率，精密度及準確度 制備5種藥物的低、中、高3個濃度的空白基質加標樣品，每一濃度進行5樣本分析，以當日隨行標準曲線計算QC樣品的濃度，同時另取空白飼料（1.00±0.02）g，除不加內標溶液外，按1.2.2項的方法制備上清液，向固相萃取柱洗脫溶劑中加入等體積的內標溶液和相應濃度的標準溶液混合后，50℃下氮氣揮干，殘渣用400μL V（甲醇）∶V（水）＝1∶1的混合溶液溶解后進樣分析，獲得相應峰面積（每個濃度5份樣品測定的平均值）。以每一濃度下兩份基質加標質量濃度相同的樣品待測物與內標峰面積比值計算相對回收率，結果列于表3。連續(xù)5天對相同的空白飼料低、中、高3個濃度加標樣品進行批處理，計算方法的日內日間精密度和準確度。結果表明，本方法測定馬飼料中5類抗凝血藥物的日內精密度、日間精密度和準確度良好，可以滿足檢測的要求，結果列于表4。

2.4 質譜譜圖解析

5種藥物的主要碎片碎裂途徑的推測示于圖2～6。

雙香豆素的主要碎片離子為m/z 161.1的負離子，將碎裂能量加大至40eV得到較強的脫掉中性碎片CO后的m/z 117.0負離子。苯茚二酮的結構中有2個羰基，分別失掉一個CO分子后得到m/z193.1和m/z164.9的負離子，加大碎裂能量到35eV時得到m/z 145.0的負離子，進一步加大碎裂能量到40eV以上時得到m/z117.0的負離子，推斷分別為失掉C6H4中性分子和進一步失掉CO后得到的碎片離子。

表3 5種藥物的加標提取回收率Table 3 The relative recoveries of five drugs in feed（n＝5）

表4 5種藥物的日內、日間精密度和準確度Table 4 Inter－day and intra－day assay accuracy and precision data for five drugs

芐丙酮香豆素的主要碎片m/z 250.1為脫掉丙酮奇電子離子后的負離子，當碎裂能量達到25eV時出現(xiàn)明顯的m/z161.1離子峰，當碎裂能量達到40eV以上時有明顯的m/z 117.0離子峰。香豆素分子在正離子模式下有更好的響應，主要通過脫掉CO和CO2中性分子形成穩(wěn)定的帶有芳香性的m/z91.0和102.9的碳正離子。

圖2 雙香豆素的裂解過程Fig.2 Possible fragmentation pathway of dicoumarin

圖3 苯茚二酮的裂解過程Fig.3 Possible fragmentation pathway of phenidione

圖4 芐丙酮香豆素的裂解過程Fig.4 Possible fragmentation pathway of warfarin

圖5 香豆素的裂解過程Fig.5 Possible fragmentation pathway of counarin

圖6 醋硝香豆素的裂解過程Fig.6 Possible fragmentation pathway of acenocoumarin

醋硝香豆素響應最強的碎片離子為m/z 265.1，推測為準分子離子失去一分子O＝C＝CH－NO2。當碎裂能量加到40eV以上時有明顯的 m/z 145.1離子峰，推測為失去一個C8H8O分子，另外還有較強的 m/z 161.1，117.1的離子峰。經(jīng)過中性丟失掃描（neutral loss）證實在碰撞能量達到20eV，MS1從260到360有一個明顯的質量數(shù)87（C2HNO3）的中性碎片丟失，MS1從100到260有一個明顯的質量數(shù)為120（C8H8O）的中性碎片丟失。上述結果表明，m/z161.1，117.1為4－羥基香豆素類抗凝血藥物的主要特征碎片，可作為該類抗凝血劑衍生物的特征篩查離子。

3 結論

本實驗建立了馬飼料中的4種香豆素類抗凝血劑和1種茚二酮類抗凝血劑同時快速篩查和定量分析的液相色譜－質譜法，該方法的預處理較為便捷、高效，且有較好的專屬性、重現(xiàn)性和靈敏度，適用于復雜基質中該類藥物的痕量分析和測定。

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