張建中 李旭洲

（揚子江藥業(yè)集團，江蘇 泰州 225321）

伏格列波糖是一種雙糖酶抑制劑，在腸道內(nèi)可抑制將雙糖分解為單糖的雙糖水解酶，延遲糖類在小腸的消化和吸收，改善餐后高血糖，同時不伴有內(nèi)源性胰島素分泌的增加。伏格列波糖最早由日本武田制藥公司（Takeda）開發(fā)，1999年在我國上市，且價格昂貴。為了造福更多的糖尿病患者，揚子江藥業(yè)集團研制了伏格列波糖膠囊（0.2mg），滿足臨床用藥需求。據(jù)文獻報道，目前伏格列波糖含量測定有HPLC-ELSD[1]、RID-HPLC[2]等方法。本文根據(jù)公司實際情況，采用HPLC柱后衍生熒光[3]測定伏格列波糖膠囊含量，取得了較為滿意的結(jié)果。

1 儀器與試藥

Waters 510高效液相色譜儀；Waters 474熒光檢測器；HW色譜工作站。

伏格列波糖對照品（上海三維制藥有限公司提供，按干燥品計算，含C10H21NO799.8%）；伏格列波糖膠囊（揚子江藥業(yè)集團）；磷酸鹽緩沖液（pH3.5）：取磷酸二氫鈉二水合物3.12g，加水1000mL使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH至（3.5±0.1）即得；0.12%辛烷磺酸鈉的磷酸鹽緩沖液（pH3.5）：取辛烷磺酸鈉1.2g，加磷酸鹽緩沖液（pH3.5）1000mL使溶解，即得；熒光試劑溶液：取牛磺酸6.25g與高碘酸2.56g，加水1000mL使溶解，即得。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Cosmosil C18柱（5μm，250mm×4.6mm i.d.），柱溫35℃，理論塔板數(shù)按伏格列波糖計算應不低于4500。

流動相：甲醇-0.12%辛烷磺酸鈉的磷酸鹽緩沖液（pH3.5）（10∶90）。

流速：調(diào)節(jié)流動相流速，使伏格列波糖峰保留時間約為14min，距主成分保留時間前4.5min以內(nèi)出現(xiàn)的峰均為雜質(zhì)峰。

熒光檢測器，激發(fā)光波長為350nm，發(fā)射光波長為430nm，柱后衍生化；反應浴溫度約100℃，聚四氟乙烯反應管長20m（內(nèi)徑0.5mm）；冷卻浴溫度約15℃，聚四氟乙烯反應管長2m（內(nèi)徑0.3mm）；熒光試劑溶液的流速與流動相的流速相同。

2.2 空白輔料干擾試驗

按照處方比例制備空白輔料膠囊，并配制成空白輔料溶液，進樣200μL，結(jié)果無干擾。見圖1。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

圖1 空白輔料及伏格列波糖對照品HPLC圖

按照選定色譜條件，進對照液200μL，按n=5.54（tR/Wh/2）2，以伏格列波糖峰計算理論塔板數(shù)為5590，拖尾因子為1.03。連續(xù)進樣5針，伏格列波糖峰面積RSD=0.61%，均符合規(guī)定。

2.4 線性范圍與標準曲線

精密稱取伏格列波糖對照品約20mg，置100mL容量瓶中，加水溶解，稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液3.5mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL、6.5mL，置50mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。分別進樣200μL，以濃度C（μg/mL）為橫坐標，峰面積A為縱坐標，進行線性回歸，結(jié)果回歸方程為：A=1.332×104+1.329×104C，r=0.99999。結(jié)果表明，伏格列波糖在13.94～25.90μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性。見表1。

表1 線性范圍與標準曲線

2.5 溶液穩(wěn)定性考察

取伏格列波糖膠囊適量，除去膠囊殼，將內(nèi)容物混合均勻，研細，精密稱取適量（約相當于伏格列波糖2.0mg），置100mL量瓶中，加水適量，超聲使伏格列波糖溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。將供試品溶液于室溫放置0，2，6，12h，進行測定。結(jié)果表明本品溶液12h內(nèi)穩(wěn)定。見表2。

表2 樣品溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果表

2.6 回收率試驗

取對照品適量按照處方比例及工藝制備不同含量的伏格列波糖膠囊，其含量分別約相當于標示量的70%，100%，130%。用制備的上述伏格列波糖膠囊進行加樣回收試驗，結(jié)果伏格列波糖回收率為99.85%，RSD=0.41%。見表3。

2.7 重復性試驗

取伏格列波糖膠囊適量，除去膠囊殼，將內(nèi)容物混合均勻，研細，精密稱取適量（約相當于伏格列波糖2.0mg），置100mL量瓶中，加水適量，超聲使伏格列波糖溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。照含量測定方法測定6次，結(jié)果表明本方法重復性較好。見表4。

2.8 中間精密度試驗

照含量測定方法由不同操作者不同時間測定同一批樣品的含量，結(jié)果表明本方法中間精密度良好。見表5。

表3 回收率試驗結(jié)果表

表4 重復性試驗結(jié)果表

表5 中間精密度試驗結(jié)果

2.9 樣品含量測定

取本品20粒的內(nèi)容物，精密稱定，研細，精密稱取適量（約相當于伏格列波糖2mg），置100mL容量瓶中，加水適量，超聲使伏格列波糖溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液；領(lǐng)取伏格列波糖對照品適量，精密稱定，加水溶解并稀釋制成每1mL中約含20μg伏格列波糖的溶液，作為對照品溶液。精密量取上述兩種溶液各200μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按照外標法以峰面積計算，即得。

對三個批次的樣品含量進行測定，結(jié)果含量均在90.0%～110.0%，見表6。

表6 含量測定結(jié)果表

3 討 論

3.1 用本法測定伏格列波糖膠囊含量，快速簡便，精密度高，結(jié)果準確，重復性試驗及回收率試驗RSD均小于0.5%。

3.2 空白輔料干擾試驗表明，伏格列波糖膠囊所用輔料對含量測定無影響。

3.3 溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示本品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定，確保了測定結(jié)果的可靠性。

3.4 因本品規(guī)格為0.2mg，測定溶液濃度小，所以進樣量較大，達200μL；液相色譜儀每次的取樣量為100μL，取樣體積較大，在同一個取樣瓶中抽兩次之后，瓶中易形成負壓，導致再抽樣時取樣量不準，故需在每次抽樣后將瓶蓋打開，然后再抽樣，以保證進樣的準確性。

[1]曾潔.RID-HPLC法測定伏格列波糖口腔崩解片中伏格列波糖含量[J].中國藥事,2008,22(12)：1093-1094.

[2]王欣榮,孫敏,何璧梅,等.HPLC-ELSD測定法在伏格列波糖生產(chǎn)中的運用[J].中國抗生素雜志,2009,34(12)：730-733.

[3]徐瑾,張慶合,張維冰,等.液相色譜熒光衍生法在糖類物質(zhì)分析中的應用[J].色譜,2003,21(2)：115-120.