李舸遠(yuǎn)，陳東亞，蔡美明，陳民輝，王 玉

江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所，南京 210008

去乙酰毛花苷（Deslanoside）是由毛花洋地黃葉中提取的毛花洋地黃苷丙，經(jīng)去乙?；玫降幕衔?，又名去乙酰西地蘭、去乙酰毛花洋地黃苷丙。該原料藥制成的注射液主要用于治療心力衰竭。由于其作用較快，適用于急性心功能不全或慢性心功能不全急性加重的患者[1-2]。隨著該注射液的廣泛使用，其不良反應(yīng)的報(bào)道也逐漸增多。該注射液常見(jiàn)的不良反應(yīng)有心律失常[3]、胃納不佳或惡心、嘔吐（刺激延髓中樞）、下腹痛，異常的無(wú)力、軟弱，其中心律失常最為重要，為此，有必要對(duì)該注射液的安全性進(jìn)行研究。然而，目前對(duì)該注射液的有關(guān)物質(zhì)研究報(bào)道較少，在各國(guó)藥典中，對(duì)該品種有關(guān)物質(zhì)的規(guī)定都限量較寬且不夠具體[4－5]。本文主要對(duì)去乙酰毛花苷注射液的雜質(zhì)進(jìn)行研究，為進(jìn)一步監(jiān)測(cè)去乙酰毛花苷注射液的不良反應(yīng)，對(duì)其安全性進(jìn)行再評(píng)價(jià)，以及提高去乙酰毛花苷注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100 series LC/MSD Trap高效液相色譜離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀；Bruker AV-500型核磁共振儀；Thermo Nicolet 6700型傅立葉變換紅外分光光度計(jì)；島津UV-3600型紫外分光光度計(jì)；YM-3型熔點(diǎn)儀；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；電熱手提高壓蒸汽消毒器。

1.2 試藥與試劑

去乙酰毛花苷注射液及同批原料（國(guó)內(nèi)某藥業(yè)有限公司，注射液批號(hào)：100401，規(guī)格0.2 mg·mL-1，原料批號(hào)：091201）；去乙酰毛花苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；地高辛苷元對(duì)照品（USP）；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；氯仿、乙醇、甘油均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

原料、雜質(zhì)A、去乙酰毛花苷對(duì)照品、地高辛苷元對(duì)照品分別用甲醇配制成約0.2 mg·mL-1。

輔料溶液：按處方量取甘油50g、95%乙醇100 mL，加水至1000 mL，搖勻。

酸破壞：取去乙酰毛花苷原料兩份，各加1 mol· L-1鹽酸5 mL，放置2 h，用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至中性。

堿破壞：取去乙酰毛花苷原料兩份，各加1 mol· L-1氫氧化鈉溶液5 mL，放置2 h，用1 mol·L-1鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至中性。

氧化破壞：取去乙酰毛花苷原料加30%雙氧水2 mL，放置4 h。

光照破壞：取去乙酰毛花苷原料在3000Lx光照條件下分別放置5d、10d。

上述破壞均用輔料溶液配制成約0.2 mg·mL-1。

高溫破壞：取去乙酰毛花苷原料，用輔料溶液配制成約0.2 mg·mL-1，分別于121℃高壓滅菌20、40、60、120、240、720 min。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX－SB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：乙腈-甲醇 （232∶148）；流動(dòng)相B：水；流速：1.0 mL·min-1；梯度洗脫：0～20 min流動(dòng)相A 38%、20～22 min流動(dòng)相A由38%升至52%、45～47 min流動(dòng)相A又降至38%繼續(xù)平衡5min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。

電噴霧離子源（ESI），源電壓4.5 kV，毛細(xì)管溫度：270℃，毛細(xì)管電壓20V，載氣流速70 mL·min-1，正負(fù)離子檢測(cè)，掃描方式：全掃描一級(jí)質(zhì)譜，相對(duì)碰撞能量100%，質(zhì)量數(shù)范圍100～2000。進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比為1∶4。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取“2.1”項(xiàng)下各溶液，分別按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，考察色譜條件專屬性及樣品雜質(zhì)情況。結(jié)果酸、堿、氧化、光照及高溫破壞供試品溶液中的各雜質(zhì)均能良好分離，輔料對(duì)雜質(zhì)檢測(cè)無(wú)干擾。去乙酰毛花苷注射液中以歸一化法測(cè)含量大于0.1%的主要雜質(zhì)有7個(gè)，分別依次命名為雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G，其中最大的雜質(zhì)為雜質(zhì)A。結(jié)果表明，去乙酰毛花苷在高溫、酸、光照的條件下均可產(chǎn)生雜質(zhì)A，以高溫條件下產(chǎn)生的較多。見(jiàn)圖1～4。

圖1 供試品溶液中主要雜質(zhì)典型色譜圖

圖2 去乙酰毛花苷原料破壞試驗(yàn)匯總圖

圖3 去乙酰毛花苷原料破壞試驗(yàn)匯總圖從上至下依次為原液、光照破壞5天、10天

圖4 去乙酰毛花苷原料破壞試驗(yàn)匯總圖從上至下依次為原液、高溫破壞20、40、60、120、240、720 min

2.4 雜質(zhì)A的制備、分離與純化

取去乙酰毛花苷原料3 g，用輔料溶液配制成約0.2 mg·mL-1，121℃ 120 min后，注入預(yù)先制備好的大孔樹(shù)脂（Amberlite XAD-6）柱中進(jìn)行吸附，先以水、20%乙醇水溶液各洗脫一個(gè)柱體積，再以100%乙醇洗脫，收集100%乙醇洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到固體A。再進(jìn)行硅膠柱層析，以氯仿-甲醇（10∶1.2）為洗脫液洗脫，收集雜質(zhì)A的濃集部分洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得雜質(zhì)A的粗品，反復(fù)進(jìn)行硅膠柱層析，得到雜質(zhì)A的精制品，再經(jīng)甲醇重結(jié)晶，裝于西林瓶中，置盛有五氧化二磷的減壓干燥器中，40℃減壓干燥24 h，即得。

2.5 雜質(zhì)A的紫外光譜解析

取雜質(zhì)A與去乙酰毛花苷對(duì)照品用甲醇配制成約10 μg·mL-1，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍掃描測(cè)定UV光譜圖。雜質(zhì)A與去乙酰毛花苷的紫外光譜圖完全一致，最大吸收波長(zhǎng)均為220 nm。去乙酰毛花苷分子結(jié)構(gòu)中具有C=C和C=O的共軛結(jié)構(gòu)，其中C=O是強(qiáng)吸收，吸收系數(shù)ε＞104。雜質(zhì)A與去乙酰毛花苷均符合甲型強(qiáng)心苷元的吸收特征，以此推斷：雜質(zhì)A與去乙酰毛花苷具有相同的苷元母核共軛結(jié)構(gòu)。

2.6 雜質(zhì)A的紅外光譜解析

取雜質(zhì)A、地高辛苷元對(duì)照品與KBr粉末混勻、研細(xì)、壓片，在4000～400 cm-1波數(shù)范圍測(cè)定。結(jié)果雜質(zhì)A與地高辛苷元對(duì)照品的紅外光譜一致。

2.7 主要雜質(zhì)的質(zhì)譜解析

取注射液和“2.1”項(xiàng)下的雜質(zhì)A溶液、去乙酰毛花苷對(duì)照品溶液、地高辛苷元對(duì)照品溶液，分別按“2.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果雜質(zhì)A溶液與注射液中雜質(zhì)A及地高辛苷元對(duì)照品溶液的一級(jí)質(zhì)譜顯示出相同的m/z 413.5、m/z 803.5、m/z 389.5，推測(cè)分別為 [M+Na]+峰、[2M+Na]+峰、[M-H]+峰，可以推測(cè)雜質(zhì)A的分子量為390.5，分子式為C23H34O5，初步確定為地高辛苷元。雜質(zhì)C的一級(jí)質(zhì)譜顯示出m/z 521.6、m/z 519.6，推測(cè)分別為[M+H]+峰、[M-H]+峰，推測(cè)雜質(zhì)C分子量為520.6，分子式為C29H44O8，初步確定為Digoxigenin Monodigitoxoside。雜質(zhì) E的一級(jí)質(zhì)譜顯示出 m/z 651.7、m/z 649.7，推測(cè)分別為[M+H]+峰、[M-H]+峰，推測(cè)雜質(zhì)E分子量為650.7，分子式為C35H54O11，初步確定為Digoxigenin Bisdigitoxoside。

2.8 雜質(zhì)A的核磁共振及綜合解析

取雜質(zhì)A以CD3OD溶解并繪制1H-NMR、13CNMR。雜質(zhì)A：白色粉末，熔點(diǎn)210℃，熔融同時(shí)分解。Legal反應(yīng)顯陽(yáng)性，噴以10%硫酸乙醇試劑顯橙色，提示該化合物可能為甲型強(qiáng)心苷類化合物。1HNMR結(jié)果顯示：δ 5.90（1H，s）和δ 4.92（2H，dd）兩個(gè)質(zhì)子信號(hào)分別為五元不飽和內(nèi)酯環(huán)上22位及21位H信號(hào)，δ 0.97（3H，s）和δ 0.79（3H，s）分別為18、19位甲基氫信號(hào)。13C-NMR化學(xué)位移結(jié)果與文獻(xiàn)[6]報(bào)道的Digoxigenin的13C-NMR數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為地高辛苷元，Digoxigenin，化學(xué)名：3β，12β，14-三羥基-5β-強(qiáng)心甾-20（22）-烯內(nèi)酯。

3 討 論

3.1 本次實(shí)驗(yàn)的色譜條件，對(duì)2010版《中國(guó)藥典》收載的去乙酰毛花苷有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)對(duì)梯度的調(diào)整，使得色譜圖的基線更加平穩(wěn)，有利于雜質(zhì)F的檢測(cè)。

3.2 曾經(jīng)按“2.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件同時(shí)對(duì)去乙酰毛花苷注射液及其生產(chǎn)時(shí)使用的對(duì)應(yīng)批號(hào)原料進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)分析測(cè)定，結(jié)果原料中未檢出雜質(zhì)A，可見(jiàn)注射液中雜質(zhì)A產(chǎn)生主要來(lái)源于制劑工藝。

3.3 由破壞性試驗(yàn)結(jié)果顯示，去乙酰毛花苷原料在酸破壞、光照破壞條件下降解產(chǎn)生雜質(zhì)A、C、E（見(jiàn)圖1、2），在121℃高溫破壞下也同樣均可產(chǎn)生雜質(zhì)A、C、E，其中雜質(zhì)C、E的量在120 min時(shí)達(dá)到最大，720 min時(shí)幾乎完全轉(zhuǎn)化為雜質(zhì)A。根據(jù)上述破壞試驗(yàn)以及對(duì)雜質(zhì)A的質(zhì)譜分析結(jié)果，推測(cè)降解產(chǎn)生雜質(zhì)A的可能途徑如下：去乙酰毛花苷在酸、光照、高溫等條件下，三處洋地黃毒糖基的氧苷鍵發(fā)生斷裂產(chǎn)生雜質(zhì)A（雜質(zhì)C、E的制備、分離及結(jié)構(gòu)鑒定由另文發(fā)表），其可能的降解途徑見(jiàn)圖5。

3.4 按“2.2”項(xiàng)下色譜條件在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)雜質(zhì)A進(jìn)行掃描檢測(cè)，結(jié)果顯示其純度為99.9%。曾測(cè)得雜質(zhì)A熔點(diǎn)為210℃，熔融時(shí)同時(shí)分解，與地高辛苷元對(duì)照品（來(lái)源：USP）說(shuō)明書提供的熔點(diǎn)（210℃）相同。

3.5 取雜質(zhì)A、去乙酰毛花苷原料用甲醇配制成0.1 mg·mL-1的溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，結(jié)果雜質(zhì)A、去乙酰毛花苷原料均在220 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，且紫外光譜圖完全一致。去乙酰毛花苷分子結(jié)構(gòu)中具有紫外吸收的化學(xué)鍵為苷元結(jié)構(gòu)中的C=C和C=O的共軛結(jié)構(gòu)，其中C=O是強(qiáng)吸收，吸收系數(shù)ε＞104，根據(jù)紫外光譜圖判斷雜質(zhì)A與去乙酰毛花苷具有相同的苷元母核共軛結(jié)構(gòu)。

圖5 去乙酰毛花苷降解產(chǎn)生雜質(zhì)A的途徑示意圖

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