智 利 王立強(qiáng) 許瑞安 刁 勇

（華僑大學(xué)分子藥物研究所，福建泉州 362021）

基因藥物經(jīng)歷了幾十年的研發(fā)已經(jīng)從實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)展進(jìn)入臨床試驗(yàn)和應(yīng)用階段，要使臨床更廣泛地使用基因治療所必須突破的一個瓶頸是發(fā)展有效的基因治療載體。一種理想載體應(yīng)同時滿足高轉(zhuǎn)染活性和低毒性。脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是目前最有前途的基因治療方法，已被美國癌癥協(xié)會批準(zhǔn)為臨床基因治療的第一方案[1]。近年來脂質(zhì)體的研究已經(jīng)從單一功能向多功能脂質(zhì)體的方向發(fā)展，使得阻礙臨床應(yīng)用的毒性、穩(wěn)定性、靶向性等問題通過新材料、新技術(shù)、新治療方案的研究取得了不同程度的突破。本文對幾種新型的載基因脂質(zhì)體用于治療腫瘤的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 陽離子脂質(zhì)體

陽離子脂質(zhì)體用于基因治療已有20多年歷史，是現(xiàn)今研究最為詳盡的一種轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體。Joanna等[2]的研究表明復(fù)合物粒徑在200nm～1μm時，復(fù)合物通過細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷作用進(jìn)入細(xì)胞，有效避免了溶酶體對DNA的降解。通過新工藝、新技術(shù)及新復(fù)合材料的實(shí)驗(yàn)研究獲得的專屬性更強(qiáng)的陽離子脂質(zhì)體是近年來研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)。劉洋等[3]由十八烷胺(SA）/DOPE通過薄膜超聲-吸附-冷凍干燥法制備的載反義寡核苷酸(asODN）陽離子脂質(zhì)體對機(jī)體的免疫原性小，用海藻糖做凍干保護(hù)劑，凍干后4℃放置1個月穩(wěn)定性良好。Charoensit[4]用維甲酸結(jié)合膽固醇和DOTAP制備的陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)IL-12質(zhì)粒DNA，對小鼠靜脈注射后29d存活率仍為100%，而沒有結(jié)合維甲酸的陽離子脂質(zhì)體組小鼠存活率僅為60%，表明維甲酸的結(jié)合顯著延長小鼠的存活時間。

研究脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系是設(shè)計合理的脂質(zhì)體的基礎(chǔ)，陽離子脂質(zhì)體與DNA親和力高易形成復(fù)合物，然而高親和力可能是轉(zhuǎn)染的限制性因素，因?yàn)樵诩?xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中脂質(zhì)體/DNA的高親和力會導(dǎo)致分離困難，轉(zhuǎn)染率降低。

2 長循環(huán)脂質(zhì)體

長循環(huán)脂質(zhì)體是通過親水性長鏈對脂質(zhì)體進(jìn)行修飾，在脂質(zhì)體表面形成水化層，降低網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES）的攝取，從而延長脂質(zhì)體在血液循環(huán)中的時間，以獲得更充足的時間到達(dá)靶向部位。有研究表明粒徑是影響長循環(huán)脂質(zhì)體循環(huán)時間的重要因素。Awasthi等[5]的研究顯示，脂質(zhì)體經(jīng)PEG修飾后粒徑在160～220nm范圍時，肝攝取量最小，脾攝取量適中，血液循環(huán)量達(dá)到最大值，是最適合長循環(huán)的脂質(zhì)體粒徑。脂質(zhì)體中PEG含量也會顯著影響循環(huán)時間進(jìn)而影響腫瘤靶向性。Emmanuel等[6]研究發(fā)現(xiàn)摩爾百分?jǐn)?shù)DSPE-PEG200020%、DC-Chol 50%制備的PEG修飾的陽離子脂質(zhì)體對小鼠靜脈注射后在血液循環(huán)中的半衰期長達(dá)12.5h，并且在腫瘤部位的累積比無PEG修飾脂質(zhì)體高3倍，證明了高PEG含量、高陽性成分含量制備的脂質(zhì)體既能延長循環(huán)時間又增加了腫瘤靶向性。在長循環(huán)脂質(zhì)體的PEG末端連接小分子基團(tuán)會對轉(zhuǎn)染效率及毒性造成影響。Hyun等[7]用聚-L-精氨酸-PEG復(fù)合物來修飾陽離子脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系H4II-E時分別比未修飾陽離子脂質(zhì)體和PEG修飾陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染率高10.26%和17.65%，并且此時脂質(zhì)體在H4II-E和HepG2細(xì)胞系中細(xì)胞毒性是最小的。

3 p H敏感脂質(zhì)體

1993年Nabel用DOPE制備載目的基因的pH敏感脂質(zhì)體直接瘤內(nèi)注射治療黑色素瘤，結(jié)果表明其具有一定療效且對患者無危害，這是脂質(zhì)體介導(dǎo)基因治療的首次臨床實(shí)驗(yàn)。然而，pH敏感脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的效率不如陽離子脂質(zhì)體高，這主要是因?yàn)楹笳叩臄y載效率高達(dá)100%[8]。Bellavance等[9]結(jié)合了二者的優(yōu)點(diǎn)，用DOPE和DC-Chol制備了粒徑80nm的pH敏感的陽離子脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞F98和U-118，在兩種細(xì)胞系中均是6h內(nèi)有明顯的內(nèi)吞作用，轉(zhuǎn)染后12h進(jìn)入細(xì)胞核，而不含DOPE的陽離子脂質(zhì)體的胞內(nèi)傳遞不明顯。采用特殊材料或結(jié)合抗體、PEG等制備特殊性能的pH敏感脂質(zhì)體能達(dá)到提高靶向性和轉(zhuǎn)染效率的目的。Reddy等[10]用N-檸康酰基-二油酰磷脂?；?乙醇胺(C-DOPE）制備pH敏感脂質(zhì)體，并連接了PEG和葉酸，此脂質(zhì)體在中性條件下穩(wěn)定，pH為5時C-DOPE迅速水解成DOPE，使脂質(zhì)體膜與胞內(nèi)體膜發(fā)生融合而釋放DNA。作為DNA轉(zhuǎn)移載體，大大提高了微酸性環(huán)境下過表達(dá)葉酸受體的腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

4 免疫脂質(zhì)體

國外的一些公司正在開發(fā)抗腫瘤免疫脂質(zhì)體，加拿大Biomira公司在用人工合成的抗原開發(fā)脂質(zhì)體疫苗BLP25，該疫苗可以使機(jī)體對腫瘤相關(guān)抗原mucin MUC1產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)。INEX公司正在進(jìn)行Oligovax(一段具有免疫增強(qiáng)活性的寡核苷酸）和TRP-2(tyrosinase related protein-2，一種黑色素瘤相關(guān)抗原）聯(lián)用治療黑色素瘤的研究。

雖然免疫脂質(zhì)體在體外表現(xiàn)出了很好的靶向特性，但連接在脂質(zhì)體表面的抗體能誘發(fā)RES對脂質(zhì)體的吞噬而導(dǎo)致體內(nèi)靶向效率不盡如人意，一個有效的解決辦法就是將免疫脂質(zhì)體技術(shù)和PEG修飾結(jié)合而達(dá)到理想的靶向效率。貝伐單抗抗體能夠在表達(dá)VEGF的腫瘤細(xì)胞選擇性累積，Kuesters等[11]在長循環(huán)陽離子脂質(zhì)體的PEG末端連接了貝伐單抗免疫調(diào)節(jié)劑，結(jié)果表明貝伐單抗的連接增加了人胰腺癌細(xì)胞系Capan-1、HPAF-II和PANC-1和表達(dá)VEGF的內(nèi)皮細(xì)胞系MS1-VEGF對脂質(zhì)體的攝取，明顯增加了脂質(zhì)體在腫瘤組織和腫瘤血管的靶向性。然而，Kirpotin等[12]提供的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明抗HER2免疫脂質(zhì)體與抗原的結(jié)合并沒有增加脂質(zhì)體在腫瘤部位的累積。作者認(rèn)為定位腫瘤的限速步驟是脂質(zhì)體從腫瘤血管的滲漏，而抗原抗體相互作用不會促進(jìn)這一過程。Zhou等[13]研究了脂質(zhì)體相關(guān)的配體親和力和密度對脂質(zhì)體在腫瘤細(xì)胞攝取的影響，結(jié)果表明配體的密度對于細(xì)胞攝取脂質(zhì)體是很重要的，配體密度高時，高親和力就不是必須的了。

5 受體介導(dǎo)的脂質(zhì)體

葉酸受體(FR）在腫瘤細(xì)胞膜表面的表達(dá)可比正常組織高出100～300倍，葉酸受體的激活能引發(fā)癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移以及腫瘤血管增生有關(guān)的主要下游級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Hanjie等[14]合成了賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽(OQLCS），制備了粒徑160nm的葉酸-PEG修飾的陽離子脂質(zhì)體，熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，由于葉酸介導(dǎo)的內(nèi)吞作用使得脂質(zhì)體在體外人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中轉(zhuǎn)染活性顯著增加。

轉(zhuǎn)鐵蛋白可協(xié)助血漿糖蛋白運(yùn)載鐵離子至正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞由于快速生長對鐵離子的需求相對大于正常細(xì)胞，往往都過度表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TR）。Pirollo等[15]用轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的陽離子脂質(zhì)體包封抑癌基因RB94質(zhì)粒，尾靜脈注射給膀胱癌小鼠，Western blot檢測到腫瘤部位RB94基因有顯著表達(dá)，并且長達(dá)150d腫瘤無明顯增長，而同劑量的無轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾組沒有明顯信號，表明經(jīng)轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾顯著增強(qiáng)了陽離子脂質(zhì)體的腫瘤細(xì)胞靶向性。

此外，用PEG和抗體修飾載DNA脂質(zhì)體，能夠顯著提高脂質(zhì)體對腫瘤細(xì)胞的靶向性。Pirollo等[16]研究表明抗體和PEG修飾的載DNA脂質(zhì)體，外源基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)是單純由抗體修飾的載DNA脂質(zhì)體的2倍，說明抗體和PEG的共同修飾起到了協(xié)同作用。

6 細(xì)胞穿膜肽修飾的脂質(zhì)體

一種新型的高效運(yùn)輸載體-蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(protein transduction domains，PTDs）或稱細(xì)胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPPs）修飾的脂質(zhì)體是把一些特殊蛋白質(zhì)中的一小段氨基酸序列連接到脂質(zhì)體上，能穿透細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜，攜帶大分子物質(zhì)進(jìn)入胞質(zhì)和胞核發(fā)揮生物效應(yīng)[17]。2004年Wadia等[18]提出的CPPs連接大分子(分子量＞30000Da）轉(zhuǎn)入細(xì)胞的主要機(jī)制是巨胞飲作用。

TATp是最常用的CPPs，來源于HIV-1編碼的轉(zhuǎn)錄激活因子。Tseng等[19]研究發(fā)現(xiàn)TATp修飾的脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)移與連接到脂質(zhì)體表面的肽分子的數(shù)量是成比例的，連接的TATp越多越易進(jìn)入細(xì)胞。Gupta等[20]用TATp修飾的脂質(zhì)體載質(zhì)粒GFP(pEGFPN1），粒徑250nm，對裸鼠腦腫瘤進(jìn)行瘤內(nèi)注射結(jié)果顯示，與對照組未修飾脂質(zhì)體相比，明顯增強(qiáng)了目的基因在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)而不影響腫瘤附近的正常細(xì)胞。

八聚精氨酸(R8）是另一個廣泛使用的CPPs，攝取時細(xì)胞表面硫酸肝素蛋白聚糖作為非特異性受體[17]。Zhang等[21]用R8修飾的脂質(zhì)體載siRNA在SK-MES-1肺癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率顯著高于Lipofectamine 2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，在血漿中顯示了很好的穩(wěn)定性，并且能有效抑制靶基因的表達(dá)，明顯降低了腫瘤細(xì)胞的增殖。

近幾年提出了“智能”脂質(zhì)體(“smart”liposome）的概念，即在脂質(zhì)體傳遞的第一階段非特異性的細(xì)胞穿透功能被聚合物保護(hù)層掩蔽，當(dāng)脂質(zhì)體累積到靶部位后，聚合物保護(hù)層或特異性配體在局部的病理?xiàng)l件下(異常的pH或溫度）分離，暴露出細(xì)胞穿透功能，傳遞藥物到細(xì)胞中。見圖1。Sawant等[22]制備了PEG-PE和TATp修飾的智能脂質(zhì)體，PEG和PE間由pH敏感的腙鍵連接，TATp連接到PEG末端。在pH 5.0～6.0孵育15～30min后脂質(zhì)體被癌細(xì)胞大量攝取，由于PEG-PE間腙鍵被水解，暴露了TATp的功能，發(fā)生巨胞飲作用。給小鼠瘤內(nèi)注射此脂質(zhì)體介導(dǎo)的pGFP 72h后目的基因大量表達(dá)，而TATp和非pH敏感的PEG修飾的脂質(zhì)體介導(dǎo)pGFP在腫瘤細(xì)胞中只有很少的轉(zhuǎn)染，因?yàn)镻EG保護(hù)層使得脂質(zhì)體與細(xì)胞膜間形成立體阻礙，隱蔽了TATp的功能。

CPPs修飾的脂質(zhì)體技術(shù)為脂質(zhì)體的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了新思路，然而，肽類難以預(yù)料的翻譯后修飾及前體肽剪切位點(diǎn)的不確定性，腫瘤細(xì)胞表面受體表達(dá)的復(fù)雜性和多樣性是其廣泛應(yīng)用的限制因素。因此，PTDs修飾的脂質(zhì)體的研究尚需進(jìn)一步努力，但可以肯定的是，這是一種很有前途的靶向給藥系統(tǒng)。

圖1 “智能”脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)

脂質(zhì)體材料的選擇需要綜合考慮各方面的因素，如與DNA的親和力、在血液中的穩(wěn)定性、與細(xì)胞膜的融合能力等。近幾年出現(xiàn)的新材料MS09、PEI800-Chol等，對基因轉(zhuǎn)染效率高、毒性小，極具應(yīng)用潛力。同時新的制備工藝、SUV融合法、改進(jìn)的乙醇注入法、薄膜-凍融法等，也使脂質(zhì)體的性能有一定程度的改善。

除了制備材料的選擇和制備方法的改進(jìn)，目前研究最多的是將多種新型脂質(zhì)體技術(shù)綜合應(yīng)用，如用PEG修飾的同時連接特異性配體，通過共同修飾達(dá)到協(xié)同作用、進(jìn)一步揭示脂質(zhì)體在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移機(jī)制及其與細(xì)胞之間的反應(yīng)機(jī)制等也是該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)之一。

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