智 利 王立強 許瑞安 刁 勇

（華僑大學分子藥物研究所，福建泉州 362021）

基因藥物經(jīng)歷了幾十年的研發(fā)已經(jīng)從實驗室研究發(fā)展進入臨床試驗和應(yīng)用階段，要使臨床更廣泛地使用基因治療所必須突破的一個瓶頸是發(fā)展有效的基因治療載體。一種理想載體應(yīng)同時滿足高轉(zhuǎn)染活性和低毒性。脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移被認為是目前最有前途的基因治療方法，已被美國癌癥協(xié)會批準為臨床基因治療的第一方案[1]。近年來脂質(zhì)體的研究已經(jīng)從單一功能向多功能脂質(zhì)體的方向發(fā)展，使得阻礙臨床應(yīng)用的毒性、穩(wěn)定性、靶向性等問題通過新材料、新技術(shù)、新治療方案的研究取得了不同程度的突破。本文對幾種新型的載基因脂質(zhì)體用于治療腫瘤的最新研究進展進行綜述。

1 陽離子脂質(zhì)體

陽離子脂質(zhì)體用于基因治療已有20多年歷史，是現(xiàn)今研究最為詳盡的一種轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體。Joanna等[2]的研究表明復(fù)合物粒徑在200nm～1μm時，復(fù)合物通過細胞膜穴樣內(nèi)陷作用進入細胞，有效避免了溶酶體對DNA的降解。通過新工藝、新技術(shù)及新復(fù)合材料的實驗研究獲得的專屬性更強的陽離子脂質(zhì)體是近年來研究者們關(guān)注的焦點。劉洋等[3]由十八烷胺(SA）/DOPE通過薄膜超聲-吸附-冷凍干燥法制備的載反義寡核苷酸(asODN）陽離子脂質(zhì)體對機體的免疫原性小，用海藻糖做凍干保護劑，凍干后4℃放置1個月穩(wěn)定性良好。Charoensit[4]用維甲酸結(jié)合膽固醇和DOTAP制備的陽離子脂質(zhì)體介導IL-12質(zhì)粒DNA，對小鼠靜脈注射后29d存活率仍為100%，而沒有結(jié)合維甲酸的陽離子脂質(zhì)體組小鼠存活率僅為60%，表明維甲酸的結(jié)合顯著延長小鼠的存活時間。

研究脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系是設(shè)計合理的脂質(zhì)體的基礎(chǔ)，陽離子脂質(zhì)體與DNA親和力高易形成復(fù)合物，然而高親和力可能是轉(zhuǎn)染的限制性因素，因為在細胞質(zhì)和細胞核中脂質(zhì)體/DNA的高親和力會導致分離困難，轉(zhuǎn)染率降低。

2 長循環(huán)脂質(zhì)體

長循環(huán)脂質(zhì)體是通過親水性長鏈對脂質(zhì)體進行修飾，在脂質(zhì)體表面形成水化層，降低網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES）的攝取，從而延長脂質(zhì)體在血液循環(huán)中的時間，以獲得更充足的時間到達靶向部位。有研究表明粒徑是影響長循環(huán)脂質(zhì)體循環(huán)時間的重要因素。Awasthi等[5]的研究顯示，脂質(zhì)體經(jīng)PEG修飾后粒徑在160～220nm范圍時，肝攝取量最小，脾攝取量適中，血液循環(huán)量達到最大值，是最適合長循環(huán)的脂質(zhì)體粒徑。脂質(zhì)體中PEG含量也會顯著影響循環(huán)時間進而影響腫瘤靶向性。Emmanuel等[6]研究發(fā)現(xiàn)摩爾百分數(shù)DSPE-PEG200020%、DC-Chol 50%制備的PEG修飾的陽離子脂質(zhì)體對小鼠靜脈注射后在血液循環(huán)中的半衰期長達12.5h，并且在腫瘤部位的累積比無PEG修飾脂質(zhì)體高3倍，證明了高PEG含量、高陽性成分含量制備的脂質(zhì)體既能延長循環(huán)時間又增加了腫瘤靶向性。在長循環(huán)脂質(zhì)體的PEG末端連接小分子基團會對轉(zhuǎn)染效率及毒性造成影響。Hyun等[7]用聚-L-精氨酸-PEG復(fù)合物來修飾陽離子脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)染人肝癌細胞系H4II-E時分別比未修飾陽離子脂質(zhì)體和PEG修飾陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染率高10.26%和17.65%，并且此時脂質(zhì)體在H4II-E和HepG2細胞系中細胞毒性是最小的。

3 p H敏感脂質(zhì)體

1993年Nabel用DOPE制備載目的基因的pH敏感脂質(zhì)體直接瘤內(nèi)注射治療黑色素瘤，結(jié)果表明其具有一定療效且對患者無危害，這是脂質(zhì)體介導基因治療的首次臨床實驗。然而，pH敏感脂質(zhì)體介導基因轉(zhuǎn)染的效率不如陽離子脂質(zhì)體高，這主要是因為后者的攜載效率高達100%[8]。Bellavance等[9]結(jié)合了二者的優(yōu)點，用DOPE和DC-Chol制備了粒徑80nm的pH敏感的陽離子脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞F98和U-118，在兩種細胞系中均是6h內(nèi)有明顯的內(nèi)吞作用，轉(zhuǎn)染后12h進入細胞核，而不含DOPE的陽離子脂質(zhì)體的胞內(nèi)傳遞不明顯。采用特殊材料或結(jié)合抗體、PEG等制備特殊性能的pH敏感脂質(zhì)體能達到提高靶向性和轉(zhuǎn)染效率的目的。Reddy等[10]用N-檸康?；?二油酰磷脂?；?乙醇胺(C-DOPE）制備pH敏感脂質(zhì)體，并連接了PEG和葉酸，此脂質(zhì)體在中性條件下穩(wěn)定，pH為5時C-DOPE迅速水解成DOPE，使脂質(zhì)體膜與胞內(nèi)體膜發(fā)生融合而釋放DNA。作為DNA轉(zhuǎn)移載體，大大提高了微酸性環(huán)境下過表達葉酸受體的腫瘤細胞的轉(zhuǎn)染效率。

4 免疫脂質(zhì)體

國外的一些公司正在開發(fā)抗腫瘤免疫脂質(zhì)體，加拿大Biomira公司在用人工合成的抗原開發(fā)脂質(zhì)體疫苗BLP25，該疫苗可以使機體對腫瘤相關(guān)抗原mucin MUC1產(chǎn)生特異性的細胞免疫反應(yīng)。INEX公司正在進行Oligovax(一段具有免疫增強活性的寡核苷酸）和TRP-2(tyrosinase related protein-2，一種黑色素瘤相關(guān)抗原）聯(lián)用治療黑色素瘤的研究。

雖然免疫脂質(zhì)體在體外表現(xiàn)出了很好的靶向特性，但連接在脂質(zhì)體表面的抗體能誘發(fā)RES對脂質(zhì)體的吞噬而導致體內(nèi)靶向效率不盡如人意，一個有效的解決辦法就是將免疫脂質(zhì)體技術(shù)和PEG修飾結(jié)合而達到理想的靶向效率。貝伐單抗抗體能夠在表達VEGF的腫瘤細胞選擇性累積，Kuesters等[11]在長循環(huán)陽離子脂質(zhì)體的PEG末端連接了貝伐單抗免疫調(diào)節(jié)劑，結(jié)果表明貝伐單抗的連接增加了人胰腺癌細胞系Capan-1、HPAF-II和PANC-1和表達VEGF的內(nèi)皮細胞系MS1-VEGF對脂質(zhì)體的攝取，明顯增加了脂質(zhì)體在腫瘤組織和腫瘤血管的靶向性。然而，Kirpotin等[12]提供的實驗數(shù)據(jù)表明抗HER2免疫脂質(zhì)體與抗原的結(jié)合并沒有增加脂質(zhì)體在腫瘤部位的累積。作者認為定位腫瘤的限速步驟是脂質(zhì)體從腫瘤血管的滲漏，而抗原抗體相互作用不會促進這一過程。Zhou等[13]研究了脂質(zhì)體相關(guān)的配體親和力和密度對脂質(zhì)體在腫瘤細胞攝取的影響，結(jié)果表明配體的密度對于細胞攝取脂質(zhì)體是很重要的，配體密度高時，高親和力就不是必須的了。

5 受體介導的脂質(zhì)體

葉酸受體(FR）在腫瘤細胞膜表面的表達可比正常組織高出100～300倍，葉酸受體的激活能引發(fā)癌細胞增殖、凋亡、遷移以及腫瘤血管增生有關(guān)的主要下游級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導。Hanjie等[14]合成了賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽(OQLCS），制備了粒徑160nm的葉酸-PEG修飾的陽離子脂質(zhì)體，熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，由于葉酸介導的內(nèi)吞作用使得脂質(zhì)體在體外人乳腺癌細胞系MCF-7中轉(zhuǎn)染活性顯著增加。

轉(zhuǎn)鐵蛋白可協(xié)助血漿糖蛋白運載鐵離子至正常細胞，腫瘤細胞由于快速生長對鐵離子的需求相對大于正常細胞，往往都過度表達轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TR）。Pirollo等[15]用轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的陽離子脂質(zhì)體包封抑癌基因RB94質(zhì)粒，尾靜脈注射給膀胱癌小鼠，Western blot檢測到腫瘤部位RB94基因有顯著表達，并且長達150d腫瘤無明顯增長，而同劑量的無轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾組沒有明顯信號，表明經(jīng)轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾顯著增強了陽離子脂質(zhì)體的腫瘤細胞靶向性。

此外，用PEG和抗體修飾載DNA脂質(zhì)體，能夠顯著提高脂質(zhì)體對腫瘤細胞的靶向性。Pirollo等[16]研究表明抗體和PEG修飾的載DNA脂質(zhì)體，外源基因在腫瘤細胞中的表達是單純由抗體修飾的載DNA脂質(zhì)體的2倍，說明抗體和PEG的共同修飾起到了協(xié)同作用。

6 細胞穿膜肽修飾的脂質(zhì)體

一種新型的高效運輸載體-蛋白轉(zhuǎn)導域(protein transduction domains，PTDs）或稱細胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPPs）修飾的脂質(zhì)體是把一些特殊蛋白質(zhì)中的一小段氨基酸序列連接到脂質(zhì)體上，能穿透細胞膜、細胞核膜，攜帶大分子物質(zhì)進入胞質(zhì)和胞核發(fā)揮生物效應(yīng)[17]。2004年Wadia等[18]提出的CPPs連接大分子(分子量＞30000Da）轉(zhuǎn)入細胞的主要機制是巨胞飲作用。

TATp是最常用的CPPs，來源于HIV-1編碼的轉(zhuǎn)錄激活因子。Tseng等[19]研究發(fā)現(xiàn)TATp修飾的脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)移與連接到脂質(zhì)體表面的肽分子的數(shù)量是成比例的，連接的TATp越多越易進入細胞。Gupta等[20]用TATp修飾的脂質(zhì)體載質(zhì)粒GFP(pEGFPN1），粒徑250nm，對裸鼠腦腫瘤進行瘤內(nèi)注射結(jié)果顯示，與對照組未修飾脂質(zhì)體相比，明顯增強了目的基因在腫瘤細胞的表達而不影響腫瘤附近的正常細胞。

八聚精氨酸(R8）是另一個廣泛使用的CPPs，攝取時細胞表面硫酸肝素蛋白聚糖作為非特異性受體[17]。Zhang等[21]用R8修飾的脂質(zhì)體載siRNA在SK-MES-1肺癌細胞中的轉(zhuǎn)染效率顯著高于Lipofectamine 2000介導的轉(zhuǎn)染，在血漿中顯示了很好的穩(wěn)定性，并且能有效抑制靶基因的表達，明顯降低了腫瘤細胞的增殖。

近幾年提出了“智能”脂質(zhì)體(“smart”liposome）的概念，即在脂質(zhì)體傳遞的第一階段非特異性的細胞穿透功能被聚合物保護層掩蔽，當脂質(zhì)體累積到靶部位后，聚合物保護層或特異性配體在局部的病理條件下(異常的pH或溫度）分離，暴露出細胞穿透功能，傳遞藥物到細胞中。見圖1。Sawant等[22]制備了PEG-PE和TATp修飾的智能脂質(zhì)體，PEG和PE間由pH敏感的腙鍵連接，TATp連接到PEG末端。在pH 5.0～6.0孵育15～30min后脂質(zhì)體被癌細胞大量攝取，由于PEG-PE間腙鍵被水解，暴露了TATp的功能，發(fā)生巨胞飲作用。給小鼠瘤內(nèi)注射此脂質(zhì)體介導的pGFP 72h后目的基因大量表達，而TATp和非pH敏感的PEG修飾的脂質(zhì)體介導pGFP在腫瘤細胞中只有很少的轉(zhuǎn)染，因為PEG保護層使得脂質(zhì)體與細胞膜間形成立體阻礙，隱蔽了TATp的功能。

CPPs修飾的脂質(zhì)體技術(shù)為脂質(zhì)體的跨膜轉(zhuǎn)導提供了新思路，然而，肽類難以預(yù)料的翻譯后修飾及前體肽剪切位點的不確定性，腫瘤細胞表面受體表達的復(fù)雜性和多樣性是其廣泛應(yīng)用的限制因素。因此，PTDs修飾的脂質(zhì)體的研究尚需進一步努力，但可以肯定的是，這是一種很有前途的靶向給藥系統(tǒng)。

圖1 “智能”脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)

脂質(zhì)體材料的選擇需要綜合考慮各方面的因素，如與DNA的親和力、在血液中的穩(wěn)定性、與細胞膜的融合能力等。近幾年出現(xiàn)的新材料MS09、PEI800-Chol等，對基因轉(zhuǎn)染效率高、毒性小，極具應(yīng)用潛力。同時新的制備工藝、SUV融合法、改進的乙醇注入法、薄膜-凍融法等，也使脂質(zhì)體的性能有一定程度的改善。

除了制備材料的選擇和制備方法的改進，目前研究最多的是將多種新型脂質(zhì)體技術(shù)綜合應(yīng)用，如用PEG修飾的同時連接特異性配體，通過共同修飾達到協(xié)同作用、進一步揭示脂質(zhì)體在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移機制及其與細胞之間的反應(yīng)機制等也是該領(lǐng)域研究的重點之一。

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