任燕冬 宋宏杉 陳巧云 張 寧▲

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007；2.大慶油田總醫(yī)院集團(tuán)龍南醫(yī)院，黑龍江大慶 163453）

人體皮膚顏色各不相同，與種族、年齡、性別、外界環(huán)境以及某些疾病等因素密切相關(guān)，其中黑素細(xì)胞產(chǎn)生的黑素是決定皮膚顏色的主要因素[1]，酪氨酸酶是黑素生物合成途徑中的主要限速酶，該酶活性大小決定著黑素形成的數(shù)量。杏仁含有豐富的脂肪油，具有使皮膚白嫩柔細(xì)、促進(jìn)皮膚光潔紅潤的作用，是古今公認(rèn)的美容佳品。本實(shí)驗(yàn)利用超臨界CO2技術(shù)萃取杏仁油，主要研究杏仁油對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16增殖及黑素合成的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器

BCM-10004型超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司制造）；OLYMPUS IX71倒置顯微鏡；HF-90 CO2培養(yǎng)箱；8-5K臺(tái)式低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；MK3型酶標(biāo)儀（熱電上海儀器有限公司）。

1.2 試劑

MEM培養(yǎng)基購于Gibco公司；胰蛋白、MTT購于Billab公司；PBS購于北京中杉金橋有限公司；L-dopa、TritonX-100、DMSO購于Sigma公司；小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16購于中科院上海細(xì)胞所。

1.3 方法

1.3.1 杏仁油的提取 利用超臨界CO2技術(shù)從杏仁中萃取杏仁油，備用。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)[2]選擇對(duì)數(shù)生長期的同一代細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，用含有10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液傳代，置于CO2培養(yǎng)箱37℃、5% CO2飽和濕度環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。每一次實(shí)驗(yàn)取自同一傳代細(xì)胞，初始接種細(xì)胞濃度為5000個(gè)/cm2左右。細(xì)胞接種24h后，棄上清液，添加待測藥物。在37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每一濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組不加藥物代之同量維持液，培養(yǎng)3d，1.5d后更換藥液1次。

1.3.3 細(xì)胞增殖率的測定 藥物作用72h后，每孔加入5g/L MTT溶液10μL，4h后棄上清液，每孔加入DMSO 100 μL，振蕩10min左右，在酶標(biāo)儀上檢測各孔吸光度值，波長為490nm。細(xì)胞增殖率＝［（待篩物各濃度平均吸光度值－空白組平均吸光度值）/（對(duì)照組平均吸光度值－空白組平均吸光度值）］×100%。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性測定[3]采用多巴氧化法對(duì)酪氨酸酶活性進(jìn)行測定。將作用時(shí)間已到的細(xì)胞棄上清液，磷酸鹽緩沖液（PBS）蕩洗2次，每孔加1% TritonX-100溶液100 μ L，0℃振蕩10min，30min后升溫至37℃，加入0.1% L-DOPA溶液10 μ L，孵育30min后在490nm波長處測吸收度（A）。酪氨酸酶活性影響率＝［（待篩物組平均吸光度－空白組平均吸光度）/（對(duì)照組平均吸光度－空白組平均吸光度）］×100%。

1.3.5 細(xì)胞內(nèi)黑色素含量的測定[4]將小鼠黑色素細(xì)胞B16以1×105個(gè)/mL的密度接種于6孔板，每孔3mL，孵育24h后，棄上清液，添加待測藥物，藥物作用3d后，棄上清液，PBS洗滌，每孔加入0.5mL胰酶消化細(xì)胞3min，加2mL維持液終止消化，分別計(jì)數(shù)每組細(xì)胞。細(xì)胞懸液離心，棄上清，沉淀中加入1mol/L NaOH（含10% DMSO）溶液，80℃下孵育30min，加入雙蒸水將NaOH稀釋成0.2mol/L，混勻后分別取100μL置96孔板中，475nm處測吸光度。黑色素合成抑制率＝［（待篩物組吸光度/細(xì)胞數(shù)的平均值）/（對(duì)照組吸光度/細(xì)胞數(shù)的平均值）］×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所測數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，方差齊性用t檢驗(yàn)，多組間比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 杏仁油對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16增殖的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示杏仁油濃度在0.1～100μg/mL對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞增殖無影響（P＞0.05），見表1。

2.2 杏仁油對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16酪氨酸酶活性的影響

杏仁油濃度在0.1～100 μg/mL對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16中酪氨酸酶活性具有顯著性抑制作用（P＜0.05），呈濃度依賴性抑制，且均見表2。

2.3 杏仁油對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16黑素含量的影響

杏仁油濃度在0.1～100 μg/mL對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16中黑素含量具有顯著性抑制作用（P＜0.05），呈濃度依賴性抑制，且均見表3。

3 討論

目前在人群中廣泛存在黃褐斑、雀斑、老年斑、皮膚晦暗、發(fā)黃等皮膚色素沉著等損美性疾病，嚴(yán)重影響著人們的身心健康。我國天然藥物資源豐富，大量天然藥物在歷史記載中具有調(diào)節(jié)色素沉著的作用，杏仁即是在美容、保健、化妝品行業(yè)及醫(yī)療機(jī)構(gòu)中應(yīng)用比較廣泛、療效較好的天然藥物，但目前有關(guān)杏仁美容作用的現(xiàn)代科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究比較少，機(jī)制不明。

本研究利用小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16研究杏仁油對(duì)于細(xì)胞內(nèi)黑素生成的影響，從細(xì)胞生物學(xué)的角度探討其發(fā)揮美容作用的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其可在不殺傷細(xì)胞的濃度范圍內(nèi)抑制黑素生成，并呈劑量依賴性，從而為杏仁油在治療色素沉著性皮膚病上的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

表1 杏仁油對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B 16增殖的影響(n=6)

表2 杏仁油對(duì)酪氨酸酶活性的影響(n=6)

表3 杏仁油對(duì)黑素含量的影響(n=6)

[1] 楊觀招，解士海. 龍膽草對(duì)人黑素細(xì)胞增殖及黑素合成的影響[J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2009，9（8）：884-886.

[2] 司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正. 細(xì)胞培養(yǎng)（修訂版）[M]. 北京：世界圖書出版社，2004：35-42，79-80.

[3] 張春香，尹鴻萍，王旻，等. 幾種美白活性物質(zhì)對(duì)酪氨酸酶活性的體外抑制作用及細(xì)胞毒性[J]. 中國生化藥物雜志，2005，26（2）：72-75.

[4] 張目，嚴(yán)澤民，朱少娟，等. 幾種中藥的美白作用研究[J]. 香料香精化妝品，2009，37（1）：33-36.