劉 宇, 聶東宋, 吳 喆, 劉立超, 朱政斌

(湖南理工學院 化學化工學院, 湖南 岳陽 414006)

蛇毒的研究是天然動物毒素研究的一個重要領域, 也是潛在的發(fā)現新的生物活性分子的重要資源[1].國內外的研究表明, 無論在基礎理論還是應用研究上, 蛇毒作為新型生物醫(yī)藥的分子模板、神經生物學研究的工具試劑、新型生物殺蟲劑的先導分子和蛋白質工程的框架分子等方面的研究均有不可替代的作用[2～4].

莽山烙鐵頭蛇是是蝰科腹亞科烙鐵頭蛇屬的一個新種, 同時也是我國瀕臨滅絕的物種. 根據莽山國家自然保護區(qū)陳遠輝的調查[5], 現今只在莽山國家自然保護區(qū)發(fā)現, 并且數量只有大概 300～500條. 目前只有Murakami對莽山烙鐵頭蛇毒素中的PLA2成分進行了部分研究[6～8], 而對莽山烙鐵頭蛇毒毒液的生物學功能的研究尚未見報道.

本研究對莽山烙鐵頭蛇毒液的半致死量進行了初步研究, 并采用膜片鉗全細胞記錄技術, 研究了莽山烙鐵頭蛇粗毒對大鼠背根神經節(jié)神經元TTX-R鈉離子通道、TTX-S型鈉離子通道、HVA型鈣離子通道和LVA型鈣離子通道的作用.

1 材料與方法

1.1 粗毒與動物

莽山烙鐵頭蛇粗毒由湖南省宜章縣境內莽山自然保護區(qū)陳遠輝提供, 冷凍干燥后使用.Sprague-Dawley(SD)大白鼠由本院動物房提供.

1.2 實驗試劑與所需設備

細胞外液(mmol/L): TEA-Cl 160, HEPES 10, BaCl22, glucose 10, 用KOH和HCl調節(jié)pH到7.4; 細胞內液(in mM): CsCl 120, Mg-ATP 5, Na2-GTP 0.4, EGTA 10, HEPES-CsOH 20, 用KOH和HCl調節(jié)pH到7.2.

臺式液(mmol/L): NaCl 137, KCl 5. 4, MgCl21, NaH2PO40.33, Hepes 10, Glucose 10, CaCl21. 8, 用氫氧化鈉調pH值至7.35. 無鈣臺式液為臺式液去CaCl2. 記錄鈣電流的電極內液CsCl 120, CaCl21, MgCl25,Na2ATP 5, EGTA 11, Hepes 10, Glucose 11用氫氧化銫調pH值至7.3. 記錄鈣電流的細胞外液即正常臺式液.膜片鉗放大器EPC9為HEKA公司產品(Electronid, Lambrecht, German), 拋光儀購自日本Nari 公司(Narishige, Japan).

1.3 毒液對小鼠LD50測定

取體重18～22g的昆明白小鼠30只, 雌雄不分, 隨機分成5組, 每組6只. 初毒用生理鹽水溶解, 按每公斤體重8、6.4、5.2、4.0 mg劑量腹腔注射, 對照組注射等體積的生理鹽水, 觀察24h. LD50的計算按照改進寇氏法公式:其中Xm為最大劑量的對數; p為各組動物的死亡率, 以小數表示(如 80%寫作 0.8);為各組動物死亡率的總和( p1+p2+p3+p4+p5); I為相鄰兩組劑量( D )對數值之差.

1.4 細胞急性分離

大鼠背根神經節(jié)(DRG)神經元細胞的急性分離與培養(yǎng)基本按Wang等[9]報道的方法進行, 簡述如下:將 4～8周齡Sprague-Dawley大鼠(雌雄不拘)擊昏后斷頭, 迅速取出胸腰段脊柱, 放入氧氣飽和的DMEM培養(yǎng)液中. 由剖開的椎管內側取出神經節(jié), 并在體視顯微鏡下用剪除DRG相連的神經和周圍的結締組織被膜, 然后將分離得到的DRG盡量剪碎, 置于消化試管中. 消化液配方為: 1.5mg胰蛋白酶, 3.5mg膠原酶,0.3mg DNA酶, 溶于5ml 氧氣飽和的DMEM培養(yǎng)液中, 34℃消化30 min, 其中每間隔 10 min 左右吹散組織塊一次, 消化完畢后用 7.6mg胰蛋白酶抑制劑中止酶反應. 將消化得到的細胞液經 800 rpm低速離心5min, 使細胞沉于離心管底, 小心吸去大部分消化液; 加入5ml 原代細胞培養(yǎng)液(95% DMEM培養(yǎng)液, 5%新生牛血清, 次黃嘌呤-氨喋呤胸-腺苷補充液洗一次, 吹散沉于底部的細胞, 再經800 rpm低速離心5min,去培養(yǎng)液. 加入5ml細胞培養(yǎng)液, 將沉于底部的細胞吹散均勻后, 以每皿1～1.2ml細胞液的量分裝到35mm培養(yǎng)皿中, 共分成4或5 皿, 置于CO2培養(yǎng)箱中, 在5% CO2和 95%空氣的濕潤環(huán)境中37℃培養(yǎng), 經2 hr培養(yǎng), 細胞貼壁后即可進行膜片鉗實驗.

1.5 全細胞記錄

電流記錄通過全細胞膜片鉗技術利用放大器 EPC9在電腦上進行. 計算機記錄和分析系統(tǒng)采用Pulse+Pulsefit 8.0軟件. 玻璃電極管為 100μL硼硅酸鹽玻璃毛細管. 玻璃電極兩步拉制而成, 經拋光儀(Nari- shige, Japan)拋光后電極尖端直徑約為3μm, 充灌電極液后電極電阻為1～3 M?. 膜片鉗實驗要在室溫條件下進行, 整個實驗過程中溫度的變動最多上下不超過2℃.

使用Ba2+作為Ca2+的電荷替代物, 鈣通道電流(ICa)的大小通過測得IBa值來確定. 實驗中的細胞外液(in mM): 160 TEA-Cl, 10 HEPES, 2 BaCl2, 10 glucose和200 nM TTX, 用TEA-OH調節(jié) pH到7.4; 細胞內液(in mM): 120 CsCl, 5 Mg-ATP, 0.4 Na2-GTP, 10 EGTA, 20 HEPES-CsOH, 調節(jié)pH到7.2. 當DRG細胞形成全細胞記錄模式后, 將膜電位鉗制在?90mV或?40mV, 然后去極化到?40mV或+60mv, 記錄到IBa. 測定鈉電流的細胞外液(in mM): 50 NaCl, 90 choline chloride, 20 TEA-Cl, 5 D-glucose, 5 HEPES, 1 MgCl2, 1 CaCl2,調pH到 7.4, 再在其中加入 10μM NiCl2, 用來阻斷Ca2+電流. 細胞內液: 125 CsCl, 20 NaF, 5 HEPES, 5 EGTA, 用1M CsOH調pH到7.2. 采用SigmaPlot 8.0軟件分析試驗結果.

2 結果與討論

2.1 毒液對小鼠LD50測定

利用 Bradfordf 法測得粗毒的蛋白質含量為 38.60 %, 而莽山烙鐵頭蛇粗毒對小鼠的半致死量 LD50值為4.3 mg/kg, 提示粗毒對小鼠具有較強的毒性. 此外, 經腹腔注射后, 小鼠隨即出現畏冷、全身震顫的現象; 不進食, 呼吸急促, 眼睛睜不開, 四肢癱軟, 出現爬行困難, 產生麻痹作用, 皮毛因大量出汗而聚結,失去光澤, 嚴重者出現全身抽搐、尿失禁等癥狀. 高劑量組小鼠全部死亡. 這提示粗毒中有神經毒素成分, 解剖死亡小鼠尸體, 發(fā)現肝臟、脾臟有大量淤血,提示粗毒中可能含有纖溶酶等溶血毒素成分.

2.2 莽山烙鐵頭蛇粗毒對DRG 細胞膜上鈉電流的影響

背根神經節(jié)(DRG)細胞膜上 2 種鈉通道(TTX-S 型和TTX-R 型)所占比例與細胞大小有關.一般認為直徑為 20～40 μm的細胞幾乎只含有TTX-S鈉通道, 而 TTX-R 鈉通道主要分布于直徑小于20μ m的細胞上[10]. 為觀察毒素對 2 種鈉通道的影響, 我們分別選用相應大小的DRG 細胞作為實驗對象, 在全細胞記錄模式下, 將膜電壓維持在?80mV, 以+10 mV 步幅、50 ms 時程去極化至+50mV, 分別誘導出加毒素前后的TTX-S (圖 1)和TTX-R 鈉電流(圖 2). 再根據去極化的電壓和相應誘導電流的大小作出TTX-S 和TTX-R 鈉電流的I-V曲線圖. 圖1表明, 加粗毒100 mg/L 4min 后電流幅度沒有變化, 其激活閾值和峰值電壓沒有改變, 逆轉電壓也沒有發(fā)生明顯漂移, 說明粗毒不影響TTX-S 鈉通道的離子選擇透過性. 圖2 表明, 加10 mg/L 粗毒后電流立即開始減小, 加 100 mg/L和1000 mg/L粗毒后電流的抑制現象有所加強, 表明粗毒對TTX-R鈉電流的抑制效應具有濃度依從性,上述結果表明莽山烙鐵頭蛇毒素是一種TTX-R型鈉通道阻斷劑, 而對TTX-S型鈉通道無明顯影響.

圖1 毒粗毒對TTX-S型鈉通道的阻斷作用分析

圖2 粗毒對TTX-R型鈉通道的阻斷作用分析

圖3 粗毒對HVA型鈣通道的阻斷作用分析

2.3 莽山烙鐵頭蛇粗毒對DRG細胞膜上鈣電流的影響

采用全細胞膜片鉗記錄技術觀察了莽山烙鐵頭蛇粗毒對HVA和LVA型鈣通道離子電流變化,大鼠背根神經節(jié)神經元細胞在 100mg/L和1000mg/ L作用10 min 后的Ica的I-V 曲線表明:粗毒對HVA型(圖3)和LVA(圖4)鈣通道具有明顯抑制作用, 100 mg/L和1000 mg/ L的粗毒濃度依賴性地減少 ICa. 提示粗毒中含有 HVA和LVA型鈣通道離子的抑制成分.

電壓門控性鈉通道是調節(jié)此類神經元興奮性和動作電位產生和傳播的重要離子通道[10].莽山烙鐵頭蛇毒素能濃度依賴地抑制DRG細胞膜上TTX-R鈉通道電流峰值, 中、高濃度的莽山烙鐵頭蛇毒素溶液還電壓依賴地影響通道的激活過程, 使通道電流的半激活電壓向去極化方向偏移, 導致TTX-R鈉通道必須達到更大的去極化程度方可最大激活TTX-R鈉電流, 延緩了其激活過程. 由此我們推斷, 莽山烙鐵頭蛇毒素對TTX-R鈉通道的調節(jié)可能直接干預痛覺信息中樞傳入的過程.

圖4 粗毒對LVA型鈣通道的阻斷作用分析

3 結束語

本文對莽山烙鐵頭蛇粗毒的生物學活性進行了初步研究, 確定了其對小鼠的半致死量, 同時采用膜片鉗全細胞記錄技術, 研究了莽山烙鐵頭蛇粗毒對大鼠背根神經節(jié)神經元河豚毒素不敏感(TTX-R)鈉通道、河豚毒素敏感(TTX-S)鈉通道、低電壓激活(LVA)電壓依賴性鈣離子通道和高電壓激活(HVA)鈣離子通道的影響. 下一步我們將通過分離粗毒中的各種有效成分, 并進一步確定其生物學功能.

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