解冰，勞文光，劉文宇，關(guān)默，劉小青，陶清源，王巖，趙平，戚中田

第二軍醫(yī)大學微生物學教研室，上海 200433

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)主要經(jīng)血液傳播，是引起急、慢性肝炎的重要致病因子。目前全球約有1.7億人感染HCV，大多數(shù)為慢性感染，部分感染者可發(fā)展為肝硬化和肝細胞癌，對人類健康造成了嚴重危害[1]。α干擾素聯(lián)合利巴韋林標準治療方案的療效因HCV基因型不同而差異顯著，對1型感染的持久應答率不到50%[2]。HCV基因組高度變異，其中介導HCV侵入細胞的包膜蛋白編碼基因變異性最高，由此導致的免疫逃避是HCV能在宿主體內(nèi)持續(xù)感染的重要機制，這也使得疫苗研究一直未有實質(zhì)性進展[3]。高變區(qū)1(hypervariable region 1，HVR1)位于HCV包膜E2蛋白氨基端，由27個氨基酸殘基組成。HVR1是HCV包膜E2蛋白與B類I型清道夫受體(scavenger receptor class B type I，SR-BI)結(jié)合必不可少的功能區(qū)域[4]，也是誘導中和抗體及參與HCV免疫逃避的關(guān)鍵部位[5,6]。由于HVR1的序列高變，目前尚不清楚其結(jié)構(gòu)與生物學功能的對應關(guān)系。

HCV假病毒(HCV pseudoviral particle，HCVpp)表面鑲嵌有功能性HCV包膜蛋白，內(nèi)部的結(jié)構(gòu)蛋白為人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)或小鼠白血病病毒(murine leukemia virus，MLV)的核衣殼蛋白及反轉(zhuǎn)錄酶，核心為編碼報告基因及病毒包裝信號的RNA[7,8]。HCVpp感染特性與HCV相似，是研究HCV侵入細胞機制的重要模型[7,8]。本研究以HCV1a亞型(H77株)為模板，對HVR1進行一系列缺失突變，制備各缺失突變體的HCVpp，分析不同突變對其感染力的影響，鑒定出HVR1中介導HCV感染的關(guān)鍵氨基酸殘基，這對認識HCV的感染機制及疫苗研發(fā)具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸埃希菌DH5α、人胚腎(human embryo kidney，HEK)293T細胞為本教研室保存。真核表達質(zhì)粒載體pCI-neo為Promega產(chǎn)品。H77株E1E2基因、MLV包裝質(zhì)粒pCMV-gag-pol、報告基因表達質(zhì)粒pCMV-Luc由法國國立衛(wèi)生研究院Cosset FL教授惠贈。人肝癌細胞Huh7.5由美國洛克菲勒大學丙型肝炎研究室Rice CM教授惠贈。E2多克隆抗體為BioDesign產(chǎn)品，GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記兔抗山羊IgG和兔抗小鼠IgG購自Sigma，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司。

1.2 HVR1突變體表達載體的構(gòu)建

H77株E1E2基因的HVR1缺失突變由上海捷瑞生物工程有限公司完成，連接于pMD-18T載體，E1E2基因兩端分別含NheⅠ和SmaⅠ酶切位點。將含E1E2基因的質(zhì)粒以NheⅠ和SmaⅠ酶切，回收目的片段，與經(jīng)過相同酶切的pCI-neo表達載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，用酶切及DNA測序鑒定重組質(zhì)粒。

1.3 HCVpp的制備

分別將上述H77株E1E2表達質(zhì)粒與pCMV-gag-pol及pCMV-Luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞(24孔板)，6 h后換液，加完全DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集上清液，離心去除殘余細胞，然后將上清液凍存于-80 ℃。吸除培養(yǎng)液，每孔加120 μl細胞裂解液﹝含2%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)和雞尾酒蛋白酶抑制劑的0.01 mol/L磷酸緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)，pH 7.0﹞裂解細胞，加30 μl 5×Loading Buffer，煮沸，用蛋白免疫印跡法檢測包膜E2蛋白的表達。

1.4 蛋白免疫印跡法檢測E2蛋白表達

轉(zhuǎn)染的HEK 293T細胞裂解液先進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，然后電轉(zhuǎn)移將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，以1∶2 000稀釋的E2多克隆抗體及1∶5 000稀釋的GAPDH單克隆抗體為一抗，1∶1 000稀釋的HRP兔抗羊IgG及兔抗小鼠IgG為二抗，化學發(fā)光法顯示反應條帶。

1.5 定量聚合酶鏈反應檢測HCVpp產(chǎn)量

將凍存的HEK 293T細胞培養(yǎng)上清液融化后，用RNA酶和DNA酶處理30 min，立即用病毒RNA抽提試劑(Roche)抽提RNA。取10 μl RNA，用隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄反應，反應體積25 μl。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5 μl，用熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測熒光素酶基因cDNA。將pCMV-Luc質(zhì)粒作為標準品，上游引物：5′-ATGCACATATCGAGGTGG-3′；下游引物：5′-CCCAACACCGGCATAAAG-3′，共40個循環(huán)。儀器采用Rotor-Gene 3000。結(jié)果表示為每毫升細胞培養(yǎng)上清液中熒光素酶基因RNA拷貝數(shù)。

1.6 HCVpp感染力檢測

人肝癌細胞Huh7.5接種于96孔板(104個/孔)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和非必需氨基酸的DMEM。12 h后，將50 μl含HCVpp的細胞上清液加入Huh7.5。72 h后每孔加50 μl細胞裂解液(Promega)裂解細胞，然后用Bright Glow試劑(Promega)檢測細胞裂解液的熒光素酶活性，以相對熒光素酶活性單位(relative luciferase unit，RLU)表示。

2 結(jié)果

2.1 HVR1中的缺失突變

HVR1是包膜E2蛋白中介導HCV與受體SR-BI結(jié)合的關(guān)鍵功能區(qū)域。為分析HVR1及其中的肽段和氨基酸殘基在介導HCV侵入細胞的作用，我們對H77株包膜E1E2基因中的HVR1編碼序列進行了一系列缺失突變，將缺失突變的E1E2基因插入pCI-neo表達載體，經(jīng)DNA測序、鑒定后用于制備HCVpp (表1)。

表1H77株HVR1缺失突變序列

Tab.1DeletionmutantsinHVR1ofH77isolate

No.Sequence of residuesDeletion of amino acid sitesH77ETHVTGGSAGHTTAGLVGLLTPGAKQN-D1--------AGHTTAGLVGLLTPGAKQN1-8D2------------TAGLVGLLTPGAKQN1-12D3ETHVTGGSAGHT------------KQN13-24D4ETHVTGGSAGHTTAG---------KQN16-24D5ETHVTGGSAGHTTAG------------16-27D6ETHVTGGSAGHT---LVGLLTPGAKQN13-15D7ETHVTGGSAGHTTAGLVGLLTPGA---25-27D8ETHVTGGSAGHT-AGLVGLLTPGAKQN13D9ETHVTGGSAGHTT-GLVGLLTPGAKQN14D10ETHVTGGSAGHTTA-LVGLLTPGAKQN15D11ETHVTGGSAGHTTAGLVGLLTPGA-QN25D12ETHVTGGSAGHTTAGLVGLLTPGAK-N26D13ETHVTGGSAGHTTAGLVGLLTPGAKQ-27D14---------------------------1-27

2.2 HVR1缺失突變不影響HCV包膜E2蛋白的表達

將上述各種缺失突變體質(zhì)粒與MLV包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞，用E2多克隆抗體對細胞裂解液進行蛋白免疫印跡檢測。結(jié)果顯示，全部或部分HVR1缺失的突變體質(zhì)粒在HEK 293T細胞中表達相似水平的包膜E2蛋白(圖1)，表明缺失HVR1中部分或全部氨基酸殘基對包膜E2蛋白的表達水平均無明顯影響。

H77, D1-D14 show expression products of wild envelope protein and mutants of H77 strain described in Table 1, respectively. Control shows lysate of HEK 293T cells transfected with mock vector.

圖1蛋白免疫印跡法檢測HEK293T細胞中HCV包膜E2蛋白表達

Fig.1AssayofenvelopeglycoproteinE2expressioninHEK293TcellsbyWesternblot

2.3 HVR1缺失突變不影響HCVpp的包裝

用DNA酶和RNA酶處理細胞培養(yǎng)上清液，以避免細胞內(nèi)漏出的DNA和RNA對檢測結(jié)果的影響。抽提總RNA，采用熒光定量PCR檢測HCVpp內(nèi)部的熒光素酶RNA。計算各突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上清液與完整HVR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上清液中熒光素酶RNA的相對值(%)，從而判斷HVR1突變是否影響HCVpp的包裝。結(jié)果見圖2。各突變體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的HEK 293T培養(yǎng)上清液中熒光素酶mRNA含量相似，表明HVR1中的缺失突變對HCVpp的包裝無明顯影響。

Data are the mean±SD of four independent experiments.

圖2熒光定量PCR檢測HEK293T細胞上清液中HCVpp含量

Fig.2DeterminationofHCVppinHEK293TculturesupernatantbyfluorescentquantitativePCR

2.4 介導HCVpp感染的關(guān)鍵氨基酸殘基位于HVR1的羧基端

用HCVpp感染Huh7.5細胞(接種于96孔板)，72 h后裂解細胞，檢測細胞中RLU，然后計算各突變體假病毒感染的靶細胞與原型假病毒感染的靶細胞中RLU相對值(%)。如圖3所示，與H77原型株相比，缺失HVR1第1～8位(D1)和1～12位(D2)的氨基酸殘基分別使HCVpp感染力降低約31%和19%。而缺失完整HVR1(D14)的HCVpp感染力為原型的4%，表明HVR1的存在對HCVpp的感染力至關(guān)重要。缺失第13～24位(D3)和16～27位(D5)氨基酸殘基的HCVpp感染力低于原型的8%，表明介導HCVpp感染的關(guān)鍵氨基酸殘基位于HVR1的羧基端。而缺失16～24位(D4)氨基酸殘基不僅沒有降低反而明顯增強HCVpp感染力(上調(diào)35%)，提示第13～15位和25～27位氨基酸殘基可能是介導HCVpp感染力的關(guān)鍵位點。

Data are the mean±SD of three independent experiments.

圖3氨基端與羧基端肽段缺失對HCVpp感染力的影響

Fig.3EffectsofdeletionofN-orC-terminalpeptidesonHCVppinfectivity

2.5 HVR1第13～15位和25～27位氨基酸殘基是介導HCVpp感染的關(guān)鍵氨基酸殘基

檢測第13～15位和25～27位氨基酸殘基缺失或逐一突變的HCVpp感染力，結(jié)果如圖4所示。缺失第13～15位、25～27位殘基或任意一個氨基酸殘基均導致HCVpp感染力幾乎完全喪失(低于原型的5%)，表明這6個氨基酸是介導HCVpp感染的關(guān)鍵殘基。

3 討論

HCV包膜蛋白由E1和E2 2種糖蛋白組成，是HCV中和抗體的靶抗原，兩者通過非共價鍵結(jié)合。其中， E2蛋白在介導HCV與靶細胞結(jié)合過程中起更重要的作用[9,10]。在急性感染階段，HVR1變異是HCV感染慢性化的重要原因[11,12]。HCV是多受體病毒，在HCV入侵宿主細胞過程中，SRBI是與HCV作用的第1個受體，而HVR1是HCV包膜E2蛋白與SR-BI結(jié)合必不可少的結(jié)構(gòu)區(qū)域，從而影響HCV的感染力[13-15]。目前對HVR1結(jié)構(gòu)與功能的相關(guān)性尚未見報道，而這對認識HCV的感染機制及研發(fā)抗HCV感染藥物和疫苗具有十分重要的意義。

Data are the mean±SD of three independent experiments

圖4缺失第13～15位和25～27位氨基酸殘基對HCVpp感染力的影響

Fig.4Effectsofdeletionof13-15or25-27aminoacidresiduesonHCVppinfectivity

為鑒定出HVR1中與HCV侵入細胞有關(guān)的關(guān)鍵氨基酸位點，本研究首先構(gòu)建了6種HVR1缺失突變的重組質(zhì)粒(分別缺失第1～8、1～12、13～24、16～24、16～27位氨基酸殘基和整個HVR1)，分別將這些質(zhì)粒與假病毒核心結(jié)構(gòu)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞。蛋白免疫印跡法和熒光定量PCR分析表明，HVR1中的缺失突變對HCV包膜蛋白表達和假病毒包裝無明顯影響。將各種假病毒感染Huh7.5細胞后檢測其感染力，結(jié)果表明，缺失第1～8位和1～12位氨基酸殘基的HCVpp感染力比原型株分別降低約31%和19%，缺失第13～24位和16～27位氨基酸殘基的HCVpp感染力幾乎完全喪失，但缺失第16～24位氨基酸殘基的HCVpp感染力比原型株提高35%。這些結(jié)果提示，介導HCV感染的關(guān)鍵氨基酸殘基可能位于第13～15位和25～27位。因此，我們又構(gòu)建了8種重組質(zhì)粒(分別缺失第13～15、25～27、13、14、15、25、26、27位殘基)，制備相應的假病毒后感染Huh7.5靶細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第13、14、15、25、26、27位殘基是介導HCV感染的關(guān)鍵殘基，缺失這6個氨基酸殘基中的任意一個均使HCVpp的感染力幾乎完全喪失。分析多株1a型HCV的基因序列發(fā)現(xiàn)，這6個氨基酸殘基并不保守，推測這些介導HCV侵入細胞的關(guān)鍵殘基可能與整個包膜蛋白在長期進化中逐漸適應、在功能上相互協(xié)調(diào)有關(guān)。因此，長期監(jiān)測同一感染者在不同病程階段HVR1的序列變異能更準確界定各個殘基的功能。

本研究證明，缺失HVR1的氨基端肽段對HCVpp感染力無根本性影響，表明氨基端殘基在HCV侵入細胞過程中不起重要作用，與針對H77株HVR1氨基端的單克隆抗體無中和作用的報道相符[8]。多數(shù)研究報道，HVR1的中和抗體表位位于羧基端[16,17]，因而理論上羧基端應具有更高的變異性。本研究雖證實羧基端含介導HCV感染力的關(guān)鍵殘基，但刪除羧基端的中段肽段(第16～24位殘基)不僅沒有導致HCVpp感染力下調(diào)，反而增強了感染力，而該肽段兩側(cè)的各3個殘基對HCVpp感染力至關(guān)重要。我們推測，第16～24位殘基可能參與中和表位的形成，中和抗體與該表位結(jié)合，通過空間阻遏效應干擾病毒與SR-BI受體結(jié)合。

本研究分析了14種HVR1中缺失突變的HCVpp對人肝癌細胞Huh7.5的感染力，鑒定出HVR1中第13～15位和25～27位共6個氨基酸殘基為影響HCV感染力的關(guān)鍵殘基。進一步分析這些氨基酸殘基突變導致HCVpp感染力增強或降低的機制，并鑒定出HVR1的中和表位，將為HCV感染機制研究及疫苗研制提供更有價值的信息。

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