陳興芬,單承鶯,馬世宏,張衛(wèi)明＊

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇南京 210097;2.南京野生植物綜合利用研究院,江蘇南京 210042)

側(cè)柏葉 (Cacumen platycladi)又名柏葉,叢柏葉,扁柏葉,是側(cè)柏〔Platycladus orentalis(L.)Franco〕的干燥嫩枝梢及葉。中醫(yī)認(rèn)為側(cè)柏葉氣清香,味苦澀、微辛,具有涼血止血、祛風(fēng)降濕、化痰止咳、消腫散毒、生發(fā)烏發(fā)的功效。在側(cè)柏葉的化學(xué)成分中,黃酮類的含量較為豐富,且被認(rèn)為是主要功能性成分之一[1]。通常,黃酮類化合物的提取,主要是根據(jù)其性質(zhì)和提取過程中附帶的雜質(zhì)是否容易去除從而選擇適宜的提取溶劑和提取方法,除此之外,在提取的過程中,原料的粉碎度、提取溫度、提取時間等也影響提取效率[2]。本文以正交試驗的方法,考察側(cè)柏葉總黃酮提取工藝中的最佳條件。

1 主要材料與儀器

1.1 材料及藥品

側(cè)柏葉:購于南京市先聲藥店,粉碎,過 40目篩 ,備用;

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品:中國藥品生物制品檢定所,純度99.9%;

乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、三氯化鋁均為市售分析純;

實驗用水為去離子水。

1.2 儀器

高速萬能粉碎機(jī),天津市泰斯特儀器有限公司;

METTLERAE240電子天平,上海天平儀器廠;

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;

LXJ– II離心沉淀機(jī) (4 000 r/min),上海醫(yī)用分析儀器廠;

TU-1800紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,金壇市江南儀器廠。

2 實驗方法

2.1 側(cè)柏葉總黃酮的測定

以蘆丁為標(biāo)樣,采用分光光度法測定總黃酮的含量[3,4]。側(cè)柏葉總黃酮的含量為提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)所得浸膏中總黃酮的質(zhì)量與原料側(cè)柏葉的質(zhì)量之比。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密稱取 105℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 20 mg,以 75%乙醇為溶劑,定容至 100 mL容量瓶中,配制成 0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.2 樣品溶液的配制

稱取側(cè)柏葉適量干粉,按 1∶15比例加入石油醚回流脫脂 2次,每次 2 h。脫脂后的側(cè)柏葉粉末烘干,備用。精密稱取 10 g脫脂的側(cè)柏葉干粉,按 1∶12.5的比例加入 75%乙醇熱回流提取 2次,每次2 h,合并提取液,離心,取上清液并減壓濃縮至浸膏,抽真空干燥。精密稱取 20 mg側(cè)柏葉醇提物,以75%的乙醇為溶劑,定容至 50 mL的容量瓶中,配制0.4 mg/mL的樣品溶液[1]。

2.1.3 測定波長的選擇

分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液各 0.5 mL,分別用 75%乙醇為溶劑,定容至 10 mL容量瓶中。分別吸取 2 mL,加入 2 mL 1%AlCl3顯色 10 min,以1%AlCl3為空白對照,在 200～900 nm波長范圍內(nèi)掃描[5-7]。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取 120℃常壓干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg,用 75%的乙醇定容至 100 mL作為母液,精密吸取 2、4、6、8、10 mL,分別用 75%乙醇定容至 25 mL。取不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液 2 mL,加入 1%AlCl3溶液 2 mL,以 75%的乙醇 2 mL加入 1%AlCl3溶液 2 mL作為空白對照,靜置 15 min,測定吸光度[8]。

按 2.1.2節(jié)的方法配制樣品溶液,自 2.1.4節(jié)中“加入 1%AlCl3溶液 2 mL”起,同上操作,測定總黃酮含量。

2.2 提取條件單因素實驗

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對側(cè)柏葉總黃酮含量的影響

選擇不同的乙醇體積分?jǐn)?shù):45%、55%、65%、75%、85%,按料液比 1∶12.5(g/mL)加入 75%乙醇加熱回流提取 2 h,重復(fù)提取 2次。

2.2.2 提取時間對側(cè)柏葉總黃酮含量的影響

選擇不同的提取時間 :1、1.5、2、2.5、3 h,按料液比 1∶12.5(g/mL)加入 75%乙醇加熱回流提取2 h,重復(fù)提取 2次。

2.2.3 料液比對側(cè)柏葉總黃酮含量的影響

選擇不同的料液比 (g/mL):1∶8、1∶10、1∶12.5、1∶15,加入 75%乙醇加熱回流提取 2 h,重復(fù)提取 2次。

第二，生態(tài)保護(hù)和修復(fù)工程進(jìn)展順利。開展“綠盾”國家級自然保護(hù)區(qū)監(jiān)督檢查專項行動,完成京津冀、長江經(jīng)濟(jì)帶、寧夏等15個省(區(qū)、市)生態(tài)保護(hù)紅線劃定。目前,中國正在穩(wěn)步實施一批重大生態(tài)保護(hù)與修復(fù)工程,包括天然林資源保護(hù)、退耕還林還草、退牧還草、防護(hù)林體系建設(shè)、河湖與濕地保護(hù)修復(fù)、防沙治沙、野生動植物保護(hù)及自然保護(hù)區(qū)建設(shè)等?；哪蜕郴癄顩r連續(xù)三個監(jiān)測周期實現(xiàn)面積“雙縮減”。草原面積近4億公頃,約占國土面積的41.7%,成為全國面積最大的陸地生態(tài)系統(tǒng)。自然保護(hù)區(qū)面積不斷擴(kuò)大,截至2017年底全國各種類型、不同級別的自然保護(hù)區(qū)總面積達(dá)到147.17萬平方千米。

2.3 提取條件正交試驗設(shè)計及驗證

2.3.1 提取條件正交試驗設(shè)計

在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,選取確定的最優(yōu)條件,以總黃酮的含量為指標(biāo),選用 L9(34)正交試驗,考察乙醇體積分?jǐn)?shù) (A)、提取時間 (B)和料液比(C)對提取效果的影響,從而確定最佳提取工藝條件。因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

2.3.2 驗證實驗

準(zhǔn)確稱量側(cè)柏葉 3份,每份 10 g,按確定的最佳條件提取,每份樣品溶液平行測定 3次,計算總黃酮平均含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 側(cè)柏葉總黃酮含量的測定

3.1.1 測定波長的確定

經(jīng)AlCl3顯色后的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液在 415 nm處有特征吸收峰,故選用 AlCl3顯色法測定側(cè)柏葉總黃酮的含量,并確定 415 nm為檢測波長。

3.1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度 C為橫坐標(biāo),吸光度 A為縱坐標(biāo)作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2.1。求得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:C=0.030 3x-0.017 3(R2=0.999 7),表明蘆丁質(zhì)量濃度在 8～40μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.3 側(cè)柏葉樣品中總黃酮含量

以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品,采用 AlCl3顯色,在 415 nm處測定總黃酮含量為 1.65%。

3.2 提取條件單因素實驗結(jié)果

3.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對側(cè)柏葉總黃酮得率的影響

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對側(cè)柏葉總黃酮含量的影響

實驗結(jié)果表明,隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,側(cè)柏葉總黃酮含量亦增大,乙醇體積分?jǐn)?shù)在 65%和 75%時變化不大,在 75%時達(dá)到最大值,后隨著體積分?jǐn)?shù)的增大反而降低。可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)越大,黃酮類物質(zhì)溶出的效果越好,但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,一些醇溶性雜質(zhì)溶出量增加,與黃酮類物質(zhì)競爭同醇 -水分子的結(jié)合,從而導(dǎo)致總黃酮含量降低,因此,乙醇體積分?jǐn)?shù)選在 75%左右較為合適。

3.2.2 提取時間對側(cè)柏葉總黃酮得率的影響

側(cè)柏葉總黃酮含量隨時間的延長略有增加,2 h達(dá)到最大值,不過在 1.5 h和 2 h之間變化幅度不大,之后隨提取時間的延長逐漸降低?？赡芘c長時間強(qiáng)熱效應(yīng)對側(cè)柏葉中黃酮類物質(zhì)產(chǎn)生破壞,從而使其降低,從節(jié)省能源的角度考慮,選取提取時間為1.5 h。

圖3 提取時間對側(cè)柏葉總黃酮含量的影響

3.2.3 料液比對側(cè)柏葉總黃酮得率的影響

圖4 料液比對側(cè)柏葉總黃酮含量的影響

隨著乙醇比例的升高,側(cè)柏葉總黃酮含量亦升高,當(dāng)料液比為 1∶15時,達(dá)到最高,但是在料液比為1∶12.5時接近最大值?？赡苁且掖加昧康脑黾佑欣邳S酮類物質(zhì)向提取液中溶出。當(dāng)乙醇用量達(dá)到一定限度后,原料表面與乙醇的體積差對總黃酮溶出的影響不大,所以基本保持不變。考慮節(jié)省資源及后續(xù)處理,料液比選取為 1∶12.5。

3.3 提取條件正交實驗設(shè)計及驗證

3.3.1 提取條件正交實驗設(shè)計結(jié)果

在單因素實驗基礎(chǔ)上,對乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間和料液比 3個因素進(jìn)行了 L9(34)正交試驗,每個實驗做 3次重復(fù),其因素水平見表2,正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

由正交實驗設(shè)計直觀分析可得:單因素實驗結(jié)果中以 A2B2C2組合最佳,但正交試驗結(jié)果中以A1B3C3組合的黃酮含量最大,并且各因素對側(cè)柏葉總黃酮含量的影響主次順序為:C>A>B,同時料液比對其影響要顯著大于乙醇體積分?jǐn)?shù)及提取時間兩個因素;由方差分析結(jié)果可知,因素 C的影響顯著,A與 B的影響皆不顯著。綜上所述,考慮節(jié)省資源選取最佳提取條件為:A1B2C3即用 65%乙醇提取 2次、提取時間 1.5 h、每次料液比 1∶15的工藝條件為較佳實驗組合。

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 正交試驗方差分析表

3.3.2 正交實驗驗證

按正交試驗選取的最佳提取工藝條件 A1B2C3進(jìn)行重復(fù)試驗,所得結(jié)果重現(xiàn)性較好,測定的黃酮含量較高,結(jié)果較為理想。結(jié)果見表4。

表4 正交試驗驗證結(jié)果

4 結(jié) 論

正交實驗研究結(jié)果表明,由正交實驗設(shè)計直觀及方差分析結(jié)果可得:影響側(cè)柏葉總黃酮含量的因素大小為:料液比 >乙醇體積分?jǐn)?shù) >提取時間,同時料液的影響要顯著大于乙醇體積分?jǐn)?shù)及提取時間兩個因素;料液比對側(cè)柏葉總黃酮含量的影響顯著,其他兩個因素影響皆不顯著。綜上所述,考慮節(jié)省資源選取用 65%乙醇提取 2次、提取時間 1.5 h、每次料液比 1∶15的工藝條件為較佳組合。采用上述工藝條件進(jìn)行重復(fù)試驗,驗證該工藝重現(xiàn)性較好,總黃酮含量約為 1.7016%。

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