黃滔敏，陳念祖，王東蕾，賴永華，閆晶超，顧紀(jì)峰（復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院藥劑科，上海市 200031）

紅外光輔助萃取-HPLC法測(cè)定玄參中肉桂酸和哈巴俄苷的含量

黃滔敏＊，陳念祖#，王東蕾，賴永華，閆晶超，顧紀(jì)峰（復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院藥劑科，上海市 200031）

目的：建立測(cè)定玄參中肉桂酸和哈巴俄苷含量的方法。方法：采用紅外光輔助萃取-高效液相色譜法。色譜柱為Diamonsil C18（200mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為1%乙酸溶液-甲醇（55∶45），柱溫為25℃，流速為1mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為278nm，以外標(biāo)法計(jì)算含量。紅外光輔助萃取條件的溶劑為甲醇-水（50∶50），提取時(shí)間為5min。結(jié)果：肉桂酸和哈巴俄苷的檢測(cè)濃度均在5～100μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系（r均為0.9999）；二者平均回收率分別為101.7%和103.2%，RSD分別為0.71%和0.93%（n＝6）。結(jié)論：本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，適用于分析測(cè)定玄參中肉桂酸和哈巴俄苷的含量。

紅外光輔助萃取；高效液相色譜法；玄參；肉桂酸；哈巴俄苷；含量測(cè)定

玄參為常用中藥，具有涼血滋陰、瀉火解毒之功效，用于治療目赤、咽痛、舌絳煩渴、津傷便秘、熱病傷陰、溫毒發(fā)斑、骨蒸勞嗽、瘰疬、白喉、癰腫瘡毒等證?！吨袊?guó)藥典》記載玄參為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensisHemsl.的干燥根。哈巴俄苷為玄參中含量較高的成分，文獻(xiàn)報(bào)道其具有抗慢性炎癥、降壓、鎮(zhèn)痛、解痙、抗乙肝病毒以及免疫促進(jìn)作用[1～3]。肉桂酸為玄參中另一重要成分，具有輕瀉作用[4，5]。

文獻(xiàn)報(bào)道分析測(cè)定玄參中肉桂酸和哈巴俄苷含量的方法較多的是超聲、回流提取和索氏提取等方法。這些方法的缺點(diǎn)是耗時(shí)、消耗有機(jī)溶劑，且操作煩瑣。國(guó)內(nèi)、外尚未見(jiàn)用紅外光輔助萃取作為前處理方法分析玄參中肉桂酸和哈巴俄苷含量的文獻(xiàn)報(bào)道。筆者采用紅外光輔助萃取-高效液相色譜法測(cè)定玄參中肉桂酸和哈巴俄苷的含量，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，適用于玄參的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型HPLC儀，包括G1322A Degasser在線脫氣機(jī)、G1311A QuartPump四元泵、G1316A Column柱溫箱、G1314AVWD紫外檢測(cè)器、惠普色譜工作站及20μL手動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)（美國(guó)惠普公司）；Direct-Q純凈水發(fā)生器（美國(guó)Millipore公司）；B5500s-MTH超聲波清洗器（上海Branson超聲波儀器廠）；275W紅外燈泡（上海申游照明電器有限公司）。

玄參對(duì)照藥材（批號(hào)：1008-200003）、肉桂酸對(duì)照品（批號(hào)：110786-200503）、哈巴俄苷對(duì)照品（批號(hào)：111730-200604）均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；冰乙酸（分析純，中國(guó)振亞化工廠，批號(hào)：070514）；甲醇（色譜純，美國(guó)Tedia公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（200mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：1%乙酸溶液-甲醇（55∶45）；柱溫：25℃；流速：1mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：278nm；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 混合對(duì)照品貯備液的制備

分別精密稱取肉桂酸和哈巴俄苷對(duì)照品12.5mg，置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成2種成分濃度均為500μg·mL-1的混合對(duì)照品貯備液，置于4℃冰箱內(nèi)貯藏。再用甲醇-水（50∶50）稀釋至不同的濃度，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取藥材樣品適量，70℃干燥48h，粉碎。精密稱取藥材粉末1.0g，置100mL圓底燒瓶中，加入40mL甲醇-水（50∶50），用紅外光加熱5min，整個(gè)過(guò)程通冷凝水冷卻蒸汽。提取完成后將溶液用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，待測(cè)。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取上述混合對(duì)照品貯備液、供試品溶液各20μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，2種對(duì)照品與其他成分分離良好，理論板數(shù)均＞5000。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品貯備液；B.供試品溶液；1.肉桂酸；2.哈巴俄苷Fig1 HPLC chromatogramsA.mixed control stock solution；B.sample solution；1.cinnamic acid；2.harpagoside

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取上述混合對(duì)照品貯備液適量，用甲醇-水（50∶50）稀釋制成含肉桂酸和哈巴俄苷濃度分別為5、10、25、50、75、100μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以對(duì)照品濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得肉桂酸的回歸方程為Y＝166.2167X－22.5037（r＝0.9999）、哈巴俄苷的回歸方程為Y＝48.1292X－0.2258（r＝0.9999）。結(jié)果表明，肉桂酸和哈巴俄苷的檢測(cè)濃度均在5～100μg·mL-1范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.6 檢測(cè)限和定量限確定

按照信噪比（S/N）＝3確定肉桂酸和哈巴俄苷的檢測(cè)限分別為0.02μg·mL-1和0.6μg·mL-1；按照S/N＝10確定肉桂酸和哈巴俄苷的定量限分別為0.08μg·mL-1和2.0μg·mL-1。

2.7 精密度試驗(yàn)

取上述肉桂酸和哈巴俄苷均為10、50、100μg?·mL-13個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液適量，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算。結(jié)果，肉桂酸峰面積的RSD分別為1.25%、1.34%、1.24%（n＝5），哈巴俄苷峰面積的RSD分別為1.39%、1.40%、0.84%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批玄參粉末適量，共6份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，肉桂酸和哈巴俄苷平均含量的RSD分別為0.85%和1.71%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取已測(cè)知含量的玄參樣品粉末1g，共6份，分別精密加入混合對(duì)照品溶液（含肉桂酸0.350mg、哈巴俄苷1.400mg），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab1 Results of recovery tests（n＝6）

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、32h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，肉桂酸和哈巴俄苷峰面積的RSD分別為1.37%和2.46%（n＝6），表明供試品溶液在32h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.11 樣品含量測(cè)定

取玄參對(duì)照藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述方法進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果，玄參對(duì)照藥材中肉桂酸和哈巴俄苷的含量分別為（0.37±0.002）mg·g-1和（1.40±0.007）mg·g-1（n＝3）。本方法測(cè)得的含量同文獻(xiàn)報(bào)道[3，4]的含量測(cè)定數(shù)據(jù)比較接近，說(shuō)明本方法適用于玄參中肉桂酸和哈巴俄苷含量的測(cè)定。

3 討論

紅外光輔助萃取技術(shù)是新興發(fā)展起來(lái)的一種中藥前處理方法，其原理是：紅外光加熱過(guò)程是高能量的光穿透萃取介質(zhì)物料，最終到達(dá)物料的內(nèi)部維管束和腺泡系統(tǒng)的過(guò)程。物料在吸收紅外光能量以后，細(xì)胞內(nèi)部溫度迅速升高，致使細(xì)胞內(nèi)壓超過(guò)細(xì)胞壁最大承受力，于是細(xì)胞壁破裂，胞內(nèi)目標(biāo)成分自由流出。通過(guò)分離、提純，最終獲得目標(biāo)成分。與傳統(tǒng)的提取技術(shù)相比，紅外光輔助萃取具有設(shè)備簡(jiǎn)單、應(yīng)用范圍廣泛、萃取效率較高、可預(yù)處理批量樣品、省時(shí)、省試劑等優(yōu)點(diǎn)。該方法可以用來(lái)前處理玄參，并且能簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地測(cè)定玄參中肉桂酸和哈巴俄苷的含量。

筆者考察了水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇作為提取溶劑對(duì)肉桂酸和哈巴俄苷提取率的影響，發(fā)現(xiàn)50%甲醇提取率較高，故選其作為本試驗(yàn)提取溶劑。紅外光輔助萃取時(shí)間的加長(zhǎng)會(huì)提高提取效率，但萃取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使提取物發(fā)生分解，使提取效率降低，故筆者考察了提取時(shí)間（1、2、5、10min），結(jié)果發(fā)現(xiàn)在5min時(shí)提取效率最高。因此，本試驗(yàn)中紅外光輔助萃取的優(yōu)化條件為：甲醇-水（50∶50）作為提取溶劑，紅外光輔助提取1次，提取時(shí)間為5min。

為了驗(yàn)證紅外光輔助萃取的優(yōu)勢(shì)，筆者將紅外光輔助萃取和超聲波提取法[6]進(jìn)行了比較。紅外光輔助萃取的供試品溶液按前文所述方法制備；超聲波提取的條件為40mL溶劑（50%甲醇），超聲時(shí)間為30min，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)。兩者都在相同的色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果，在相同條件下，紅外光輔助萃取的提取效率比超聲波提取法高，而且紅外光輔助萃取的時(shí)間比超聲波提取明顯縮短，從而驗(yàn)證了紅外光輔助萃取具有較高的提取率、溶劑用量少、樣品需求量低、提取時(shí)間短等顯著優(yōu)點(diǎn)。

[1] 張洪霞，宋金玉，趙榮淑，等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定玄參中肉桂酸、哈巴俄苷的含量[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23（8）：507.

[2] 李振東，徐位良，羅嬌艷.HPLC法測(cè)定玄麥甘桔顆粒中哈巴俄苷與肉桂酸含量[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，24（2）：130.

[3] 張發(fā)科，呂青濤，張兆旺.HPLC法研究不同炮制工藝對(duì)玄參中哈巴俄苷和肉桂酸含量的影響[J].化學(xué)分析計(jì)量，2006，15（6）：51.

[4] 白志川.不同產(chǎn)地與加工方法玄參中肉桂酸的含量測(cè)定[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，28（3）：425.

[5] 肖冰梅，裴 剛，曾 夷.HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地玄參的肉桂酸含量[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（1）：117.

[6] 羅傲雪，范益軍，羅傲霜，等.不同提取方法對(duì)石斛多糖含量測(cè)定的影響[J].中國(guó)藥房，2010，21（7）：601.

Content Determination of Cinnamic Acid and Harpagoside inScrophularia ningpoensisby Infrared Heating Assisted Extraction-HPLC

HUANG Tao-min，CHEN Nian-zu，WANG Dong-lei，LAI Yong-hua，YAN Jing-chao，GU Ji-feng
（Dep.of Pharmacy，Eye&ENT Hospital Affiliated to Fudan University，Shanghai 200031，China）

OBJECTIVE：To develop a method for the content determination of cinnamic acid and harpagoside inScrophularia ningpoensis.METHODS：Infrared heating assisted extraction-HPLC（IHAE-HPLC）was adopted.The determination was performed on Diamonsil C18（200mm×4.6mm，5μm）column with 1%acetic acid solution-methanol（55∶45）as mobile phase at flow rate of 1mL·min-1.The column temperature was set at 25℃.And the detection wavelength was 278nm.The contents of cinnamic acid and harpagoside were calculated using external standard method.Cinnamic acid and harpagoside was extracted by IHAE-HPLC using methanol-water（50∶50）as solvent with extraction time of 5min.RESULTS：The linear range for cinnamic acid and harpagoside were 5～100μg·mL-1（r＝0.9999）.The average recoveries of cinnamic acid and harpagoside were 101.7%（RSD＝0.71%，n＝6）and 103.2%（RSD＝0.93%，n＝6）.CONCLUSION：The method is simple and accurate.It is adapted to determine and analyze the content of cinnamic acid and harpagoside inS.ningpoensis.

Infrared heating assisted extraction；HPLC；Scrophularia ningpoensis；Cinnamic acid；Harpagoside；Content determination

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2011）19-1796-03

＊藥師，碩士。研究方向：新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定及體內(nèi)外方法學(xué)研究。E-mail：tmhuang@fdeent.org

#通訊作者：副主任藥師。研究方向：醫(yī)院制劑。電話：021-64373955。E-mail：nianzuch@163.com

2010-05-13

2011-02-21）