許珂玉，肖建英

（遼寧醫(yī)學(xué)院，錦州市 121000）

五味子粗多糖提取物對(duì)大鼠肝纖維化的防治作用研究Δ

許珂玉＊，肖建英#

（遼寧醫(yī)學(xué)院，錦州市 121000）

目的：研究五味子粗多糖提取物對(duì)復(fù)合病因誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的防治作用。方法：實(shí)驗(yàn)分為6組，即正常對(duì)照（生理鹽水）、模型（生理鹽水）、秋水仙堿（0.1mg·kg-1）和五味子粗多糖提取物高、中、低劑量（400、200、100mg·kg-1）組。腹腔注射CCl4復(fù)制大鼠肝纖維化模型；灌胃給藥。檢測(cè)大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的活性，肝勻漿丙二醛（MDA）和羥脯氨酸（HOP）的含量以及超氧化物岐化酶（SOD）的活性；形態(tài)學(xué)上觀察肝組織病理學(xué)變化，用細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)（CIAS）對(duì)肝纖維化進(jìn)行半定量。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，Massion染色顯示模型組肝纖維化明顯，有大量膠原纖維存在，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，血清ALT和AST顯著升高，肝中MDA和HOP含量顯著升高，SOD活性顯著下降（P＜0.01）。與模型組比較，各用藥組大鼠血清ALT和AST顯著降低；肝中MDA含量下降，SOD活性升高，具有顯著性差異（P＜0.01），并呈劑量依賴效應(yīng)；肝HOP含量及膠原面積百分比顯著下降（P＜0.01）。結(jié)論：五味子多糖可減輕肝損害、肝脂質(zhì)過(guò)氧化和肝纖維化的作用。

五味子粗多糖；復(fù)合因素；肝纖維化

肝纖維化是多種慢性肝病的重要病理階段，也是肝硬化的病理基礎(chǔ)。肝纖維化的病理原因是肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cells，HSC）活化和增殖，導(dǎo)致膠原合成過(guò)量，降解相對(duì)不足，從而使以膠原纖維為主的細(xì)胞外基質(zhì)合成增多并過(guò)度沉積所致[1]。

近年來(lái)對(duì)肝纖維化發(fā)生機(jī)制的研究表明，肝纖維化是一種可以逆轉(zhuǎn)的病理改變。我國(guó)是一個(gè)肝病高發(fā)國(guó)家，因此采取積極合理的治療措施，可以逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進(jìn)程，從而達(dá)到緩減甚至治愈肝纖維化的目的，對(duì)防治肝硬化的發(fā)生、發(fā)展顯得尤為重要和緊迫[2]。

五味子為木蘭科五味子屬植物，具有補(bǔ)腎、益氣、生津、固澀等功效，臨床用于治療久咳虛喘、夢(mèng)遺滑精、津傷口渴、氣短脈虛、內(nèi)熱消渴和心悸失眠等證。五味子成分復(fù)雜，藥理作用多樣，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，其不僅對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等均有調(diào)節(jié)作用，還具有抑制腫瘤、抗氧化、抗衰老等方面作用[3]。筆者研究五味子粗多糖提取物對(duì)復(fù)合病因誘導(dǎo)的肝纖維化的防治作用，以為五味子防治肝纖維化的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CH2000型生化自動(dòng)分析儀、UV1601型紫外分光光度儀、LEICARM21-35超薄切片機(jī)（日本島津公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；細(xì)胞圖像分析儀（CIAS，北京大恒圖像有限公司）。

1.2 試藥

北五味子（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)提供，由遼寧醫(yī)學(xué)院肖建英教授鑒定為真品）；乳酸脫氫酶（LDH）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙二醛（MDA）、羥脯氨酸（HOP）試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供；所有試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)健康Wistar大鼠90只，♀♂兼半，體重（200±20）g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（遼）2008-0004）。

2 方法

2.1 五味子多糖純化

取北五味子果實(shí)500g，清水洗凈，研磨粉碎后加水4.0L，微沸煎煮1h，過(guò)濾，濾渣加水2.5L，煎煮1h，過(guò)濾，合并提取液，加熱濃縮，加入3倍量900mol·L-1乙醇，放置24h，抽濾，乙醇和丙酮交替沉淀法純化，參考文獻(xiàn)[4]方法并加以改進(jìn)，得到淺棕色粗多糖。將粗多糖溶解于水，用Seveg法除去蛋白，直至中間層無(wú)變性蛋白為止，加入10g·L-1活性炭脫色，抽濾，濾液裝于透析袋中，透析48h，除去無(wú)機(jī)離子，得微黃色多糖純化物。再將純化物經(jīng)Sephadex G-200柱層析，NaCl溶液洗脫，平衡膠柱，透析，濃縮，凍干，以葡聚糖溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用苯酚-硫酸比色法測(cè)定多糖含量。樣品含糖量約為60.3mg·g-1。

2.2 肝纖維化模型制備與分組

參照Wasser方法[5]改進(jìn)而成。sc花生油配制的10%CCl4，首次劑量為0.5mL·100mg-1，以后為0.3mL·100mg-1，每周2次，共4周。實(shí)驗(yàn)分為6組，每組15只，即正常對(duì)照（等容生理鹽水）、模型（等容生理鹽水）、秋水仙堿（0.0025%，0.1mg·kg-1）和五味子多糖高、中、低劑量（400、200、100mg·kg-1）組。ig給藥，給藥容積為0.5mL·100mg-1，每天1次，連續(xù)2周。

2.3 血清ALT、AST活性的測(cè)定

斷頭取血，靜置30min，1500r·min-1離心 5min，分離血清，用生化自動(dòng)分析儀按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定血清ALT、AST的活性。

2.4 肝勻漿MDA、HOP含量和SOD活性的測(cè)定

取大鼠肝組織，用生理鹽水制成10%的肝勻漿，4000r·min-1離心10min，取上清分別按試劑盒說(shuō)明書操作，測(cè)定MDA、HOP含量和SOD活性。

2.5 組織病理學(xué)觀察

取肝組織2.5mm左右厚度，4%甲醛固定24h，沖洗24h，梯度脫水，香柏油透明12h，浸蠟，包埋，貼塊，連續(xù)切片。分別進(jìn)行HE和Massion染色，觀察肝組織病理變化，

2.6 膠原半定量分析

每組每只大鼠做1個(gè)組織塊，連續(xù)切片，每隔10張取1張，每個(gè)組織塊取30張，作Massion染色；每張切片40倍光鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，應(yīng)用CIAS測(cè)量膠原纖維面積并求其平均值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以±s表示，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)處理均用SPSS12.0for Windows統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包完成。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血清ALT、AST活性測(cè)定

正常對(duì)照組肝血清ALT與AST在正常范圍值內(nèi)；模型組血清ALT與AST顯著高于正常值（P＜0.01），表明肝細(xì)胞受損嚴(yán)重。高、中、低劑量五味子多糖能顯著降低模型大鼠ALT及AST水平（P＜0.01），隨著藥物濃度增加，降低效果顯著，且與秋水仙堿組比較效果較好。說(shuō)明中藥治療尚需較緩慢過(guò)程，需要逐步改善。大鼠血清ALT和AST活性見表1。

表1 大鼠血清ALT和AST活性Tab1 Activities ofALT andAST in rat serum

3.2 各組大鼠肝MDA、HOP含量和SOD活性測(cè)定

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝MDA含量顯著增加，SOD活性顯著下降，HOP含量顯著增加（P＜0.01），表明CCl4對(duì)肝細(xì)胞的損傷主要是肝過(guò)氧化脂質(zhì)產(chǎn)生過(guò)多造成的。高、中、低劑量五味子多糖能顯著降低模型大鼠MDA、HOP含量，提高SOD活性（P＜0.01）。大鼠肝組織MDA、HOP含量和SOD活性見表2。

3.3 組織病理學(xué)觀察

正常對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無(wú)變形、壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生。模型組大鼠肝小葉被破壞，肝細(xì)胞充滿脂滴，有程度不等、范圍不一的肝細(xì)胞壞死區(qū)，壞死區(qū)中央和周圍有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，并形成較寬的以膠原纖維為主要成分的纖維間隔，被染成綠色，且多數(shù)膠原纖維分隔、包繞肝小葉形成假小葉。五味子多糖高、中、低劑量組較模型組纖維間隔窄、假小葉形成少，與秋水仙堿組比較治療效果更好。大鼠肝組織病理切片見圖1。

表2 大鼠肝組織MDA、HOP含量和SOD活性Tab2 Contents of MDA and HOP and SOD activity in liver tissue in each group

圖1 大鼠肝組織病理切片A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.五味子多糖高劑量組；D.秋水仙堿組Fig1 Pathological section of hepatic tissue of ratsA.normal control group；B.model group；C.Polysaccharides from S.chinensis high-dose group；D.colchicine group

3.4 各組大鼠肝纖維化測(cè)定

模型組膠原纖維面積遠(yuǎn)高于正常對(duì)照組（P＜0.01），五味子多糖高、中、低劑量組膠原纖維面積與模型組比較顯著改善（P＜0.01）。大鼠肝膠原纖維面積密度比較見表3。

表3 大鼠肝膠原纖維面積密度比較Tab3 Area density of hepatic collagen fiber of rats

4 討論

各種病因（如病毒、CCl4、乙醇、高膽固醇等）均可引起肝臟損傷，并繼發(fā)纖維化的病理過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)研究五味子多糖對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的保護(hù)作用。CCl4在肝臟經(jīng)還原活化產(chǎn)生·CCl3，后者與模型結(jié)構(gòu)中磷脂的不飽和脂肪酸結(jié)合，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使肝細(xì)胞膜、線粒體膜、微粒體膜損傷[5]。研究采用血清ALT和AST活性作為檢測(cè)肝細(xì)胞損傷的靈敏指標(biāo)，MDA含量和SOD活性反映細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化程度，HOP含量反映肝纖維化狀況。結(jié)果表明，正常肝組織切片顏色紅潤(rùn)，無(wú)顆粒沉積，小葉間有少量膠原纖維；模型組肝顏色變暗，有顆粒沉積，小葉間和匯管區(qū)有大量的膠原纖維，纖維將肝小葉重新分割形成假小葉。肝功能檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組與正常對(duì)照組比較血清ALT和AST活性明顯增高，組間比較具有顯著性差異（P＜0.01），表明模型組肝功能損傷嚴(yán)重。由于脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過(guò)氧化物，主要產(chǎn)物是MDA，所以MDA含量代表脂質(zhì)過(guò)氧化的程度；而SOD能夠催化自由基的歧化反應(yīng)，具有清除自由基作用，二者是衡量脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程的重要指標(biāo)。結(jié)果表明，模型組與正常對(duì)照組比較MDA含量增加，SOD活性下降。五味子多糖高、中、低劑量組和秋水仙堿組與模型組比較，從病理切片上可見，肝較紅潤(rùn)，小葉間纖維間隔變窄，假小葉少見，顆粒沉著減少，MDA含量降低，SOD活性升高（P＜0.01），并呈劑量依賴效應(yīng)，表明五味子多糖具有抗氧化作用，可以替代秋水仙堿。隨著肝損傷，肝細(xì)胞受損失，肝功能異常，肝將代償性增生，膠原纖維將大量生成，導(dǎo)致膠原纖維的生成大于分解，打破了動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，引起肝纖維化和假小葉的形成。本研究選用HOP及形態(tài)學(xué)作為檢測(cè)肝纖維化指標(biāo)，肝纖維化時(shí)HOP明顯升高。五味子多糖高、中、低劑量組和秋水仙堿組與模型組比較HOP含量顯著減低，其中五味子多糖低劑量組與秋水仙堿組治療效果有差別，但無(wú)顯著性差異。通過(guò)CIAS對(duì)膠原纖維密度進(jìn)行半定量分析表明，五味子多糖高、中、低劑量組和秋水仙堿組與模型組比較膠原面積明顯減少，雖然沒(méi)有完全恢復(fù)肝纖維化，但能明顯改善。

綜上所述，五味子多糖具有減輕肝纖維化、抗氧化作用。由于五味子多糖副作用小，治療效果不低于秋水仙堿，因此可考慮將其作為臨床肝纖維化治療的輔助性藥物。

（感謝各位老師、學(xué)長(zhǎng)對(duì)本研究課題的指導(dǎo)!同時(shí)也感謝遼寧中醫(yī)藥大學(xué)的同學(xué)們對(duì)筆者的大力支持!）

[1] 賈曾榮，余 震，陳必成，等.大豆異黃酮抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)肝膽外科，2009，15（10）：758.

[2] 趙治友，林庚庭，張俊杰，等.加味桃核承氣湯對(duì)四氯化碳肝纖維化大鼠α-SMA表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥，2008，23（11）：1034.

[3] 魏景文.五味子藥理研究新進(jìn)展[J].天津藥學(xué)，2009，21（5）：55.

[4] 劉 娜，樸惠善.北五味子莖藤多糖的提取和含量測(cè)定[J].延邊大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33（1）：29.

[5] 齊 彥，郭麗新，周迎春，等.五味子對(duì)四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的作用研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2009，37（4）：26.

Preventive Effects of Polysaccharides fromSchisandra chinensison Liver Fibrosis in Rats

XU Ke-yu，XIAO Jian-ying
（Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China）

OBJECTIVE：To investigate preventive effects of polysaccharides fromSchisandra chinensison multiple factors-induced liver fibrosis in rats.METHODS：Rats were randomly divided into six groups：normal control group（normal saline），model group（normal saline），high-dose，medium-dose and low-dose groups（colchicine 0.1mg·kg-1，polysaccharides fromS.chinensis400，200，100mg·kg-1）.Liver fibrosis model was established by intraperitoneal administration of CCl4and given relevant medicine via i.g.The activities of ALT and AST in serum of rats were determined and the contents of MDA and HOP were also detected as well as the activity of SOD.The pathological change of liver tissue was observed and the semi-quantitative analysis of liver fibrosis was conducted using CIAS.RESULTS：Compared with normal group，Massion staining showed obvious liver fibrosis in model group.There was collagenic fiber and lobular disorder.The serum levels of ALT and AST and the contents of MDA and HOP increased significantly，and the activity of SOD decreased significantly（P＜0.01）.Compared with model group，the serum levels of ALT and AST in treatment groups decreased significantly.The content of MDA decreased while the activity of SOD increased，there was significant difference in dose-dependent manner（P＜0.01）.The percentage of HOP and collagen declined（P＜0.01）.CONCLUSION：Polysaccharides fromS.chinensiscan relieve liver damages，lipid peroxidation and liver fibrosis

Polysaccharides fromSchisandra chinensis；Multiple factors；Liver fibrosis

R285；R97

A

1001-0408（2011）19-1743-03

Δ遼寧省教育廳基金資助項(xiàng)目（2009A469）

＊副教授，博士研究生。研究方向：中藥與腫瘤治療。電話：0416-4673253。E-mail：keyuxu2002@sina.com

#通訊作者：教授，博士。研究方向：甲狀腺腫瘤。電話：0416-4673253。E-mail：xiaojianying@yahoo.com.cn

2010-10-12

2011-01-07）