孫方迪，郭濤，侯悅，潘昊

（1.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽市 110016；2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，沈陽市 110016）

RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中的紫杉醇與漢防己甲素Δ

孫方迪1，2＊，郭濤2#，侯悅1，潘昊1

（1.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽市 110016；2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，沈陽市 110016）

目的：建立同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中紫杉醇、漢防己甲素的方法。方法：采用反相高效液相色譜法。取血漿200μL，以利血平為內(nèi)標(biāo)，利用乙醚提取，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解，進(jìn)樣20μL。色譜柱為Platisisl ODS（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.01mol·L-1K2HPO4（30∶40∶30，磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.5），流速為1.0mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為227nm。結(jié)果：紫杉醇、漢防己甲素檢測(cè)濃度分別在0.02～20μg·mL-1和0.02～5μg·mL-1（r分別為0.9990、0.9993）范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。紫杉醇和漢防己甲素低、中、高濃度的方法回收率分別為100.5%～104.0%和101.0%～104.8%，提取回收率分別為84.7%～93.8%和70.8%～86.0%；日內(nèi)、日間精密度均＜10%。結(jié)論：本方法專屬性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于紫杉醇和漢防己甲素在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究。

反相高效液相色譜法；紫杉醇；漢防己甲素；藥動(dòng)學(xué)

紫杉醇是從紫杉樹皮中提取的一種抗癌新藥，由于其化學(xué)結(jié)合新穎、作用機(jī)制獨(dú)特，故對(duì)其開發(fā)利用被譽(yù)為20世紀(jì)90年代抗腫瘤藥三大成就之一[1]。作為新型的廣譜抗腫瘤藥物，紫杉醇被廣泛用于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、頭頸部腫瘤、非小細(xì)胞性腫瘤以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療[2]。現(xiàn)行的紫杉醇制劑（Taxol?）是將紫杉醇溶于聚氧乙烯蓖麻油（Cremphor?EL）與無水乙醇1∶1的混合液中，給藥前用0.9%生理鹽水或5%葡萄糖溶液稀釋[3]。紫杉醇注射劑雖已得到廣泛的應(yīng)用，但其仍存在穩(wěn)定性、水溶性較差和嚴(yán)重過敏反應(yīng)等諸多不足?？诜o藥是最方便的給藥途徑，而紫杉醇口服時(shí)卻存在生物利用度極差的問題，難于經(jīng)口服給藥。文獻(xiàn)[2]報(bào)道，由于胃腸道上皮細(xì)胞膜上存在P-糖蛋白（P-gp），導(dǎo)致紫杉醇被泵出腫瘤細(xì)胞，出現(xiàn)臨床上的抗腫瘤藥物多藥耐藥現(xiàn)象。本課題組以抗腫瘤藥紫杉醇為模型藥，配以P-gp抑制劑——漢防己甲素，意在改變目前臨床抗腫瘤藥物的多藥耐藥現(xiàn)象，并同時(shí)提高紫杉醇口服生物利用度，降低其不良反應(yīng)，提高其臨床使用率。本研究采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，首次建立了同時(shí)測(cè)定紫杉醇、漢防己甲素的定量分析方法，以期為進(jìn)一步研究復(fù)方紫杉醇新制劑提供可行的檢測(cè)方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HPLC系統(tǒng)，包括600四元梯度泵、2487型紫外檢測(cè)器（美國Waters公司）；YKH-2型液體快速混合器（江西醫(yī)療器械廠）；KQ3200DE型超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司）；TGL-16B型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試藥

紫杉醇（上海金杉生物科技有限公司，批號(hào)：20070720，含量：＞99.8%）；利血平（廣東邦民制藥廠，批號(hào)：20050718）；漢防己甲素（西安山川生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20060113，含量：＞99.5%）；甲醇（色譜純，天津四友公司）；乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

Wistar大鼠6只，♂，體重250～300g，由沈陽藥科大學(xué)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（遼）20033008）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Platisil（鉑金）ODS（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.01mol·L-1K2HPO4（30∶40∶30，V/V/V，磷酸調(diào)節(jié)pH值至 4.5）；柱溫：室溫；流速：1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：227nm；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

2.2.1 藥物貯備溶液的制備 分別精密稱取紫杉醇、漢防己甲素10.00、5.00mg，分別用甲醇溶解并分別定容至50、100mL容量瓶中，制備成200μg·mL-1的紫杉醇貯備液和50μg·mL-1的漢防己甲素貯備液，4℃貯藏，備用。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)貯備溶液的制備：精密稱取利血平5.00mg，用甲醇溶解并定容至50mL容量瓶中，配制成100μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)貯備液，用時(shí)稀釋成25μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液，4℃貯藏，備用。

2.3 樣品處理

取血漿樣品0.2mL，加內(nèi)標(biāo)溶液20μL（25μg·mL-1），渦旋1min，加入3mL乙醚渦旋5min，4000r·min-1離心10min，將上層乙醚液移取至干凈的5mL離心管中，置于40℃水浴中用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00μL的流動(dòng)相溶解后取20μL進(jìn)樣。結(jié)果表明，在“2.1”色譜條件下，紫杉醇、漢防己甲素和利血平分離良好，峰形尖銳，無拖尾現(xiàn)象；血中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定無干擾。大鼠血漿色譜見圖1。

圖1 大鼠血漿色譜圖A.空白血漿；B.紫杉醇、漢防己甲素標(biāo)準(zhǔn)品+內(nèi)標(biāo)空白血漿；C.血漿樣品；1.紫杉醇；2.漢防己甲素；3.利血平Fig1 HPLC chromatograms of rats plasmaA.blank plasma；B.paclitaxel and tetrandrine standard+blank plasma；C.plasma sample；1.paclitaxel；2.tetrandrine；3.crystoserpine

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取大鼠血0.2mL，分別加紫杉醇、漢防己甲素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL，配制成紫杉醇濃度為0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20μg·mL-1和漢防己甲素濃度為0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5μg·mL-1的血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，取20μL進(jìn)樣分析。以血漿樣品中藥物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（A）為縱坐標(biāo)，藥物濃度（c）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得紫杉醇回歸方程為A＝0.281c+0.023（r＝0.9990）、漢防己甲素回歸方程為A＝0.535c+0.009（r＝0.9993）。結(jié)果表明，紫杉醇血藥檢測(cè)濃度在0.02～20μg·mL-1、漢防己甲素血藥檢測(cè)濃度在0.02～5μg·mL-1范圍內(nèi)同其與內(nèi)標(biāo)峰面積比值呈良好線性關(guān)系。紫杉醇和漢防己甲素最低檢測(cè)濃度均為0.01μg·mL-1。

2.5 回收率試驗(yàn)

2.5.1 提取回收率試驗(yàn) 取大鼠空白血漿0.2mL（18份），配制高、中、低濃度（紫杉醇濃度為20、1、0.05μg·mL-1，漢防己甲素濃度為5、0.5、0.05μg·mL-1）的血漿樣品各6份，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，評(píng)價(jià)提取回收率。提取回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.5.2 方法回收率試驗(yàn) 取“2.5.1”項(xiàng)下的高、中、低濃度血漿質(zhì)控樣品，評(píng)價(jià)方法回收率。方法回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1。

由表1可知，高、中、低濃度的樣品提取回收率均＞70%，高、中、低濃度的方法回收率結(jié)果的RSD均＜5%，說明該分析方法的回收率滿足體內(nèi)分析的要求。

2.6 精密度試驗(yàn)

取大鼠空白血漿0.2mL，按“2.5”項(xiàng)下方法制備高、中、低濃度（紫杉醇濃度為20、1、0.05μg·mL-1，漢防己甲素濃度為5、0.5、0.05μg·mL-1）的質(zhì)量控制樣品，分別在同一天內(nèi)測(cè)定 5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；并連續(xù)測(cè)定5d，計(jì)算日間精密度。精密度試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝6）Tab1 Results of recovery tes（t±s，n＝4）

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝6）Tab1 Results of recovery tes（t±s，n＝4）

成分 c/μg·mL-1紫杉醇漢防己甲素0.051.0020.000.050.505.00提取回收率/%84.7±2.991.7±1.193.8±1.570.8±2.577.9±1.986.0±2.2方法回收率/%102.7±3.7104.0±3.1100.5±2.2101.0±4.7104.5±2.8104.8±2.4

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab2 Results of precisions test（n＝5）

由表2可知，高、中、低濃度的血漿質(zhì)控樣品的日內(nèi)和日間RSD均＜10%，說明本分析方法的日間、日內(nèi)精密度滿足要求。

2.7 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

取空白血漿200μL，分別加入不同量的紫杉醇和漢防己甲素，制備高、中、低濃度（紫杉醇濃度為20、1、0.05μg·mL-1，漢防己甲素濃度為5、0.5、0.05μg·mL-1）的溶液，充分混勻，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，分別在室溫條件放置不同時(shí)間（0、4、8h）、凍融條件（反復(fù)凍融3次）下進(jìn)行HPLC測(cè)定。結(jié)果表明，紫杉醇、漢防己甲素在室溫和凍融條件下穩(wěn)定性良好，濃度未發(fā)生明顯變化，高、中、低濃度的RSD均＜10%。

2.8 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

取Wistar大鼠6只，ig給予自制復(fù)方紫杉醇制劑，給藥后分別于0.083、0.167、0.333、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、12、24h，后眼眶靜脈叢穿刺取血0.5mL，分離得到的血漿樣品經(jīng)預(yù)處理后進(jìn)行HPLC測(cè)定。結(jié)果表明，紫杉醇和漢防己甲素的血藥濃度值均在標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量范圍內(nèi)。血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。

3 討論

關(guān)于紫杉醇的血藥濃度測(cè)定方法已有很多報(bào)道，但同時(shí)測(cè)定血漿中紫杉醇與漢防己甲素含量的研究卻未見報(bào)道。由于紫杉醇紫外吸收波長(zhǎng)較低，受內(nèi)源性物質(zhì)干擾較大，因此有文獻(xiàn)報(bào)道用固相萃取柱[4]進(jìn)行提取分離，但成本較高。另有文獻(xiàn)報(bào)道用叔丁基甲醚[5～8]、乙酸乙酯[9]、二氯甲烷[10]提取紫杉醇，

圖2 血藥濃度-時(shí)間曲線Fig2 Plasma concentration-time profile of paclitaxel and tetrandrine in rats plasma

但是內(nèi)源性物質(zhì)干擾很嚴(yán)重。本研究采用乙醚為提取溶劑，經(jīng)過液-液萃取，方便、快捷，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾藥物的測(cè)定，且提取回收率較高。

本研究所建立的HPLC法簡(jiǎn)便、快速、分離效果好、成本低、準(zhǔn)確度和精密度好、回收率和靈敏度高，可用于紫杉醇、漢防己甲素在大鼠體內(nèi)的血藥濃度測(cè)定，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

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Simultaneous Determination of Paclitaxel and Tetrandrine in Rats Plasma by HPLC

SUN Fang-di，HOU Yue，PAN Hao
（School of Pharmacy，Shenyang Parmaceutical University，Shenyang 110016，China）
SUN Fang-di，GUO Tao
（Dept.of Pharmacy，General Hospital of Shenyang Military Region，Shenyang 110016，China）

OBJECTIVE：To establish the RP-HPLC method for the simultaneous determination of paclitaxel and tetrandrine in rats plasma.METHODS：With crystoserpine as the internal standard，the plasma sample 200μL was extracted with ether，evaporated under gentle N2stream and the residual was resolved with mobile phase.The samples were separated on Platisil ODS（250mm×4.6mm，5μm）column with a mobile phase of methol-acetonitrile-0.01mol·L-1dipotassium hydrogen phosphate（30∶40∶30，pH adjusted to 4.5with phosphoric acid）at the flow rate of 1.0mL·min-1.The detection wavelength was set at 227nm.RESULTS：The linear ranges were 0.02～20μg·mL-1（r＝0.9990）for paclitaxel and 0.02～5μg·mL-1（r＝0.9993）for tetrandrine.The method recovery was 100.5%～104.0%and 101.0%～104.8%and the extraction recovery was 84.7%～93.8%and 70.8%～86.0%，respectively.The RSD of intra-day and inter-day both were less than 10%.CONCLUSION：The method is specific，simple，accurate and reproducible for pharmacokinetics study of paclitaxel and tetrandrine in rats plasma.

RP-HPLC；Paclitaxel；Tetrandrine；Pharmacokinetics

#通訊作者：主任藥師，博士研究生導(dǎo)師。研究方向：中西藥制劑、臨床藥學(xué)。E-mail：sy-guotao@263.net

R969.1；R971+.1

A

1001-0408（2011）19-1737-03

Δ中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目（20060390978）

＊碩士研究生。研究方向：中藥新劑型。電話：024-28851435。E-mail：sunfangdi@sohu.com

2010-06-12

2010-12-09）