華卡，李健和，朱運(yùn)貴，易利丹，曹俊華，劉曉磊，陽(yáng)巧鳳，曾小慧，羅霞

（1.湖南省腦科醫(yī)院藥劑科，長(zhǎng)沙市 410007；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部，長(zhǎng)沙市 410011；3.湖南省馬王堆醫(yī)院，長(zhǎng)沙市 410016）

鹽酸甲氯芬酯膠囊在健康人體內(nèi)的生物等效性研究

華卡1＊，李健和2#，朱運(yùn)貴2，易利丹2，曹俊華3，劉曉磊2，陽(yáng)巧鳳2，曾小慧2，羅霞2

（1.湖南省腦科醫(yī)院藥劑科，長(zhǎng)沙市 410007；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部，長(zhǎng)沙市 410011；3.湖南省馬王堆醫(yī)院，長(zhǎng)沙市 410016）

目的：研究2種鹽酸甲氯芬酯膠囊在中國(guó)健康志愿者體內(nèi)的生物等效性。方法：18名健康男性志愿者隨機(jī)分為2組，分別單劑量交叉口服鹽酸甲氯芬酯膠囊受試制劑或參比制劑200mg。于服藥前0h和服藥后0.33、0.67、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、14、24h時(shí)抽取靜脈血，采用高效液相色譜法測(cè)定血漿中對(duì)氯苯氧乙酸的濃度。通過(guò)DAS Ver 2.0軟件計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，評(píng)價(jià)2制劑的生物等效性。結(jié)果：鹽酸甲氯芬酯受試制劑與參比制劑的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分別為：tmax（2.11±0.37）、（2.06±0.34）h，cmax（12.56±2.85）、（12.78±2.84）μg·mL－1，t1/2（5.81±2.68）、（6.00±2.14）h，AUC0～24（34.11±7.89）、（34.12±7.99）μg·h·mL－1，AUC0～∞（34.83±7.68）、（34.79±7.97）μg·h·mL－1。以AUC0～24計(jì)算，受試制劑對(duì)參比制劑的相對(duì)生物利用度為（100.7±11.7）%。 結(jié)論：2種鹽酸甲氯芬酯膠囊在中國(guó)健康志愿者體內(nèi)具有生物等效性。

鹽酸甲氯芬酯膠囊；對(duì)氯苯氧乙酸；高相液相色譜法；生物等效性

鹽酸甲氯芬酯是中樞興奮藥，其化學(xué)名為對(duì)氯苯氧乙酸二甲氨基乙酸鹽，臨床主要用于治療外傷性昏迷、酒精中毒、新生兒缺氧癥、兒童遺尿癥等[1～4]。2005年版《中國(guó)藥典》二部[5]和有關(guān)文獻(xiàn)[6～9]采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定其制劑的含量，但僅見(jiàn)少量文獻(xiàn)報(bào)道人血漿中甲氯酚酯測(cè)定方法[10]。因甲氯芬酯在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物為對(duì)氯苯氧乙酸，且在體內(nèi)較穩(wěn)定，故本試驗(yàn)建立一種簡(jiǎn)單、靈敏和快速的HPLC法測(cè)定18名中國(guó)健康志愿者口服鹽酸甲氯芬酯膠囊受試制劑與參比制劑后血漿中對(duì)氯苯氧乙酸的濃度，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)和相對(duì)生物利用度，評(píng)價(jià)2制劑的生物等效性。

1 材料

1.1 儀器

1100 系列高效液相色譜儀，包括化學(xué)高級(jí)色譜數(shù)據(jù)工作站（美國(guó)Agilent公司）AL-204電子分析天平（瑞典Mettler Toledo公司）；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HY-4多用調(diào)速振蕩器（江蘇金壇市醫(yī)用儀器廠）；GL-88B旋渦混合器（江蘇海門(mén)麒麟醫(yī)用儀器廠）。

1.2 試藥

受試制劑：鹽酸甲氯芬酯膠囊（湖南華納大藥廠有限公司，規(guī)格：每粒100mg，批號(hào)：20081206）；參比制劑：鹽酸甲氯芬酯膠囊（廣東先強(qiáng)藥業(yè)有限公司，每粒100mg，批號(hào)：20080902）；對(duì)氯苯氧乙酸對(duì)照品（廈門(mén)星隆達(dá)化工有限公司，含量：99.0%）；甲醇為色譜純，冰醋酸為分析純，水為雙重蒸餾水?？瞻籽獫{由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院血液科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：漢邦 C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-1%冰醋酸溶液（70∶30）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；流速：1.0mL·min－1；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：25℃。

2.2 受試者選擇

健康男性志愿者18名，年齡（23.2±1.2）歲，身高（171.0±3.4）cm，體重（61.4±4.0）kg，試驗(yàn)前進(jìn)行體格檢查，血尿常規(guī)、肝腎功能、心率、血壓和心電圖等檢查均正常；試驗(yàn)者既往體健，無(wú)藥物過(guò)敏史，無(wú)吸煙、嗜酒及經(jīng)常用藥史。2周內(nèi)未服用任何可能影響本品吸收、代謝的藥物。試驗(yàn)期間統(tǒng)一清淡飲食，不使用除受試制劑和參比制劑以外的任何藥物，不接受煙、酒及含咖啡的飲料，避免劇烈運(yùn)動(dòng)。受試者試驗(yàn)前簽署知情同意書(shū)，本試驗(yàn)方案經(jīng)湖南省腦科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

2.3 試驗(yàn)方案

采用雙周期自身隨機(jī)交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)。18名受試者隨機(jī)等分為2組，每組受試者每次試驗(yàn)時(shí)分別服用鹽酸甲氯芬酯膠囊受試制劑或參比制劑。受試者于試驗(yàn)前1日晚餐后，禁食不禁水12h，次日清晨空腹分別單劑量口服含鹽酸甲氯芬酯200mg的受試制劑或參比制劑，以250mL溫開(kāi)水送服，并作記錄。服藥2h后可自由飲水，服藥4h后進(jìn)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)餐。試驗(yàn)期間由醫(yī)護(hù)人員進(jìn)行監(jiān)護(hù)。間隔7d后交叉給藥，重復(fù)上述試驗(yàn)。分別于服藥前0h和服藥后0.33、0.67、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、14、24h時(shí)由前臂肘靜脈取血5mL。血樣置于肝素化的離心管中，立即離心（3000r·min－1）5min，分離出血漿，置－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取對(duì)氯苯氧乙酸對(duì)照品10mg，置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1000μg·mL－1的對(duì)氯苯氧乙酸貯備液。用甲醇將此貯備液稀釋成濃度為100、10、1μg·mL－1的系列對(duì)照品溶液，均置于4℃冰箱中保存，備用。

2.5 血漿樣品處理

精密吸取血漿樣品0.2mL于離心管中，加入乙腈0.7mL，渦流混旋3min，以 16000r·min－1離心3min。取上清液20μL進(jìn)樣分析。

2.6 專(zhuān)屬性考察

空白血漿、對(duì)氯苯氧乙酸對(duì)照品溶液、空白血漿+對(duì)氯苯氧乙酸對(duì)照品溶液以及健康受試者血漿樣品，經(jīng)HPLC分析測(cè)定得到色譜圖見(jiàn)圖1。對(duì)氯苯氧乙酸保留時(shí)間約為4.1min，峰形良好，基線平穩(wěn)，無(wú)雜峰干擾測(cè)定，表明本方法具有較高的特異性，能準(zhǔn)確測(cè)定血漿中對(duì)氯苯氧乙酸的濃度。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限

取離心管數(shù)支，分別精密加入不同量的對(duì)氯苯氧乙酸對(duì)照品溶液后以氮?dú)饬鞔蹈?，加入空白血漿0.2mL，渦旋混勻1min，配成血漿中含對(duì)氯苯氧乙酸分別為0.047、0.141、0.47、1.41、4.70、14.1、28.2μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度，按“2.5”項(xiàng)下方法操作，每一濃度進(jìn)行5樣本分析，進(jìn)樣20μL，記錄色譜圖及對(duì)氯苯氧乙酸峰面積。以對(duì)氯苯氧乙酸峰面積平均值（A）對(duì)血藥濃度（c）進(jìn)行回歸運(yùn)算，得回歸方程為：A＝9.2886×c+0.3433（r＝0.9969），結(jié)果表明對(duì)氯苯氧乙酸血藥濃度在0.047～28.2μg·mL－1濃度范圍線性關(guān)系良好。定量下限為0.047μg·mL－1。

2.8 精密度及回收率試驗(yàn)

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.對(duì)氯苯氧乙酸對(duì)照品溶液；C.空白血漿+對(duì)氯苯氧乙酸對(duì)照品溶液；D.受試者血漿樣品；1.對(duì)氯苯氧乙酸Fig1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.chlorophenoxyacetic acid standard solution；C.blank plasma+chlorophenoxyacetic acid standard solution；D.plasma sample of the subjects；1.chlorophenoxyacetic acid

取離心管數(shù)支，于離心管中精密加入不同量的對(duì)氯苯氧乙酸對(duì)照品溶液適量，以氮?dú)饬鞔蹈珊?，精密加入空白血漿0.2mL，渦旋混勻1min，配成含對(duì)氯苯氧乙酸0.141、1.41、4.1μg·mL－1的血漿，按“2.5”項(xiàng)下方法操作，每種濃度平行做15份樣品（3d 3批次），并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同批進(jìn)行測(cè)定，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對(duì)氯苯氧乙酸濃度，考察方法的準(zhǔn)確度與精密度，結(jié)果表明其準(zhǔn)確度與精密度符合藥動(dòng)學(xué)研究的方法學(xué)要求。精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab1 Results of precision and recovery test

2.9 絕對(duì)回收率試驗(yàn)

取離心管數(shù)支，分別取對(duì)氯苯氧乙酸對(duì)照品溶液適量于離心管中，用甲醇配成含對(duì)氯苯氧乙酸濃度分別為0.141、1.41、14.1μg·mL－1的溶液，每份0.2mL，以氮?dú)饬鞔蹈珊?，精密加入雙重蒸餾水0.2mL和乙腈0.7mL溶解殘?jiān)?，精密吸?0μL進(jìn)樣分析，記錄色譜圖和峰面積（As）。另取離心管數(shù)支，于離心管中精密加入不同量的對(duì)氯苯氧乙酸溶液適量，以氮?dú)饬鞔蹈珊?，精密加入空白血漿0.2mL，渦旋混勻1min，配成含對(duì)氯苯氧乙酸濃度分別為0.141、1.41、14.1μg·mL－1的血漿樣品，每種濃度各做5份樣品，加入乙腈0.7mL，渦旋混勻3min，于16000r·min－1離心3min，精密吸取20μL上清液進(jìn)樣分析，記錄色譜圖和峰面積（Ai）。對(duì)氯苯氧乙酸的絕對(duì)回收率＝Ai/As×100%。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取干凈離心管數(shù)支，按“2.7”項(xiàng)下方法制備含對(duì)氯苯氧乙酸濃度分別為0.141、1.41、14.1μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，每個(gè)濃度各平行制備5份，共15份，1份配制好后按“2.5”項(xiàng)下方法操作后，立即進(jìn)樣分析；1份血樣室溫放置4h后提取操作；1份提取后于4℃自動(dòng)進(jìn)樣器放置10h后進(jìn)樣分析；1份于冰箱中冷凍保存1個(gè)月后取出，解凍后提取操作；1份在1個(gè)月內(nèi)反復(fù)凍融3次后提取操作。結(jié)果顯示上述考察條件下所有樣品的測(cè)定值與添加值的RSD均＜15%，說(shuō)明分析測(cè)試過(guò)程中各個(gè)條件下的樣品均較為穩(wěn)定。

2.11 數(shù)據(jù)處理

受試制劑與參比制劑的cmax和tmax均以實(shí)測(cè)值表示；AUC0～t以梯形法計(jì)算；AUC0～∞按公式計(jì)算：AUC0～∞＝AUC0～t+ct/λZ（t為最后一次可實(shí)測(cè)血藥濃度的采樣時(shí)間；ct為末次可測(cè)樣本藥物濃度；λZ為對(duì)數(shù)藥-時(shí)曲線末端直線部份求得的末端消除速率常數(shù)）；t1/2用公式t1/2＝0.693/λZ計(jì)算。以各個(gè)受試者服用受試制劑與參比制劑的AUC0～t按下式分別計(jì)算其相對(duì)生物利用度（F）值：F＝AUC受試制劑/AUC參比制劑×100% 。主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后以多因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，然后用雙單側(cè)t檢驗(yàn)和計(jì)算90%置信區(qū)間的統(tǒng)計(jì)分析方法來(lái)評(píng)價(jià)和判斷藥物間的生物等效性。藥動(dòng)學(xué)基本參數(shù)的計(jì)算與統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析借助DAS Ver2.0軟件完成。

2.12 血藥濃度測(cè)定結(jié)果及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

18名受試者口服鹽酸甲氯芬酯膠囊受試制劑或參比制劑200mg后的平均藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖2。受試者口服鹽酸甲氯芬酯膠囊受試制劑或參比制劑200mg后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。對(duì)同一受試者2種制劑的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。以參比制劑為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，受試制劑的相對(duì)生物利用度為（100.7±11.7）%。

圖2 18名健康志愿者單劑量口服鹽酸甲氯芬酯受試制劑或參比制劑后的平均藥-時(shí)曲線Fig2 Mean plasma concentration-time curves of meclofenoxate hydrochloride in 18healthy volunteers after single oral dose of Meclofenoxate hydrochloride capsules

表2 18名健康志愿者單劑量口服鹽酸甲氯芬酯受試制劑或參比制劑后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab2 Main pharmacokinetic parameters of meclofenoxate hydrochloride in 18healthy volunteers after single oral dose of Meclofenoxate hydrochloride capsules

2.13 生物等效性評(píng)價(jià)

受試制劑和參比制劑的Cmax、AUC經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析，并進(jìn)一步采用雙單側(cè)t檢驗(yàn)和（1－2α）置信區(qū)間法進(jìn)行生物等效性評(píng)價(jià)，tmax采用非參數(shù)檢驗(yàn)法。結(jié)果表明：對(duì)氯苯氧乙酸的 AUC0～t、AUC0～∞和ρmax均拒絕生物不等效假設(shè)（P＞0.05）；受試制劑的Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的90%置信區(qū)間分別為參比制劑相應(yīng)參數(shù)的96.48%～122.90%、97.64%～111.99%和97.81%～111.73%；非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，2制劑的tmax差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。根據(jù)以上結(jié)果，判定2制劑生物等效。

2.14 不良反應(yīng)或事件

整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程由經(jīng)《藥物臨床試驗(yàn)管理規(guī)范》（GCP）培訓(xùn)的臨床醫(yī)師和護(hù)士進(jìn)行觀察，18名受試者在服用含鹽酸甲氯芬酯200mg的受試制劑或參比制劑后均無(wú)不適主訴，亦未觀察到不良事件，且均按要求完成試驗(yàn)。

3 討論

本文建立了測(cè)定人血漿中對(duì)氯苯氧乙酸濃度的HPLC法，預(yù)處理簡(jiǎn)單、快速，血樣干擾少。線性關(guān)系和樣品穩(wěn)定性均良好，其方法的精密度和準(zhǔn)確度均能符合藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗(yàn)指導(dǎo)原則對(duì)生物樣品分析的要求，測(cè)定結(jié)果可靠。

國(guó)外有關(guān)鹽酸甲氯芬酯藥動(dòng)學(xué)的研究未見(jiàn)報(bào)道，國(guó)內(nèi)有采用毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)法間接測(cè)定人血漿中鹽酸甲氯芬酯的報(bào)道[10]。18名試驗(yàn)者單劑量口服鹽酸甲氯芬酯膠囊200mg的受試制劑或參比制劑后，AUC0～t的個(gè)體間差異較大，但制劑間、周期間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

由于該試驗(yàn)的研究對(duì)象均為健康男性，且為單劑量給藥，人群范圍太窄，年齡均較年輕化，故結(jié)果不能代表和推斷出老年人群的給藥指數(shù)。

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Bioequivalence Study of Meclofenoxate Hydrochloride Capsule in Healthy Volunteers

HUA Ka
（Dept.of Pharmacy，Hunan Provincial Brain Hospital，Changsha 410007，China）
LI Jian-he，ZHU Yun-gui，YI Li-dan，LIU Xiao-lei，YANG Qiao-feng，ZENG Xiao-hui，LUO Xia
（Dept.of Pharmacy，The Second Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410011，China）
CAO Jun-hua
（Mawangdui Hospital of Hunan Province，Changsha 411016，China）

OBJECTIVE：To evaluate the bioequivalence of two kinds of Meclofenoxate hydrochloride capsule in Chinese healthy volunteers.METHODS：18healthy male volunteers were randomly divided into 2groups and given single oral dose of meclofenoxate test preparation or reference preparation 200mg.The blood samples were collected at 0h，and 0.33，0.67，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，10，14，24h after adiministrotion.The concentration of chlorophenoxyacetic acid in plasma was determined by HPLC.The pharmacokinetic parameters were calculated and the relative bioequivalence was evaluated by DAS Ver 2.0software.RESULTS：The main pharmacokinetic parameters of trial capsules vs.reference capsule of meclofenoxate hydrochloride were as follows：tmax（2.11±0.37）h vs.（2.06±0.34）h；cmax（12.56±2.85）μg·mL－1vs.（12.78±2.84）μg·mL－1，t1/2（5.81±2.68）h vs.（6.00±2.14）h；AUC0～24（34.11±7.89）μg·h·mL－1vs.（34.12±7.99）μg·h·mL－1；AUC0～∞（34.83±7.68）μg·h·mL－1vs.（34.79±7.97）μg·h·mL－1，respectively。The relative bioavailability of test capsule was（100.7±11.7）%.CONCLUSION：Two kinds of meclofenoxate hydrochloride capsules are bioequivalent in Chinese healthy volunteers.

Meclofenoxate hydrochloride capsule；Chlorophenoxyacetic acid；HPLC；Bioequivalence

R969.1；R971+.7

A

1001-0408（2011）18-1669-04

＊副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話(huà)：0731-85232243。E-mail：hkcsy2008@126.com

#通訊作者：副主任藥師，碩士。研究方向：新藥研發(fā)。電話(huà)：0731-85292093。E-mail：lijianhexy@126.com

2010-08-09

2010-10-30）