孫宜鋒，方渡

細胞色素 P450 是一類被廣泛研究的依賴于血紅素的氧化酶，因它在還原狀態(tài)下能與 CO 結(jié)合形成復(fù)合物，在450 nm 附近有最大吸收峰而命名為細胞色素 P450[1]。P450 首先在哺乳動物肝微粒體中被發(fā)現(xiàn)。迄今為止，已經(jīng)命名的 P450 有 12 000 多個。P450 廣泛分布于真核生物和原核生物中，在內(nèi)源和外源化合物的代謝中發(fā)揮重要作用[2]。P450 有較高的區(qū)域選擇性和立體選擇性，可以在比較溫和的條件下在有機化合物中引入氧，催化一系列的反應(yīng)，包括脂肪族和芳香族碳的羥化、有機氮和硫的氧化、環(huán)氧化以及 Baeyer-Villiger 氧化等。其中值得關(guān)注的是，一些 P450 酶可以催化一些活性較低的碳氫鍵的直接氧化，這類反應(yīng)在化學(xué)合成中是比較難進行的。因此，P450作為生物氧化催化劑引起了廣泛的關(guān)注[3]?？汞懰幬锴噍锼兀╝rtemisinin）是萜類天然產(chǎn)物的一種，在其生物合成途徑中（圖 1），反應(yīng)的關(guān)鍵步驟是由 P450 氧化酶催化完成的，首先倍半萜 FDP 前體 1 經(jīng) 4, 11-二烯合成酶的催化生成（2a），之后經(jīng)過 P450 氧化酶 CYP71AV1 氧化生成artemisinic acid（2b）[4]。

由于大部分 P450 酶的活性較低、壽命較短，選擇的底物范圍較小，其工業(yè)化應(yīng)用還是很少，所以需要擴大P450 酶庫，通過大規(guī)模的篩選，拓展酶的底物適應(yīng)性及選擇性。在已有的 P450 酶庫內(nèi)，對功能和結(jié)構(gòu)已知的酶，根據(jù)它們的晶體結(jié)構(gòu)，人們通過定點誘變，以及隨機突變定向進化，可以得到一些新的 P450 酶，再篩選具有特定功能的酶[5-6]；另一方面，隨著生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，越來越多的生物基因組序列被測定，這些基因組序列中包含了大量的 P450 基因，從這個巨大的基因組序列庫中尋找新的 P450 引起了人們很大的興趣。通過基因挖掘的方法尋找新的 P450 是目前比較常用的一種方法。

1 尋找新的 P450 氧化酶

根據(jù)氨基酸序列的同源性將 P450 歸于不同的家族或亞家族，同源性大于 40% 的歸為同一家族（如 CYP101），大于 55% 歸為同一亞家族（如 CYP101A）[7]。通過與已知的 P450 進行同源性比對，可以推測基因序列編碼的酶屬于某一家族，并預(yù)測它可能的底物和功能，通過聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）直接克隆得到這些 P450 基因，在合適的宿主如大腸桿菌中高效表達就可以獲得新的 P450 生物催化劑，而這些酶的底物特異性、產(chǎn)物選擇性和催化轉(zhuǎn)化率與已知的 P450 相似但不完全相同。利用這種方法，找到了已知的兩個 P450、CYP102 和 CYP152 家族的新成員。

1.1 CYP102 家族成員的發(fā)現(xiàn)

CYP102A1 是在革蘭陽性菌 B. megaterium ATCC 14581 中發(fā)現(xiàn)的，是研究的最廣泛的 P450 之一。它是一個可以自給自足的單加氧酶，包含一個血紅素結(jié)構(gòu)域，一個雙黃素還原酶結(jié)構(gòu)域和它們的連接區(qū)域。這個獨特的結(jié)構(gòu)使其具有比其他 P450 更高的催化及轉(zhuǎn)化效率。CYP102A1利用 NADPH 作為電子供體，催化長鏈脂肪酸近末端位置的羥化，它對不飽和脂肪酸底物選擇性高于飽和脂肪酸和支鏈脂肪酸[8]。CYP102A1 基因的同源基因，命名為CYP102A2、CYP102A3、CYP102A5、CYP102A7，分別從B.subtilis、B.subtilis、Bacillus cereus、Bacillus licheniformis中鑒定出來。利用 Blast 程序分析表明，CYP102A2 和CYP102A3[9]分別與 CYP102A1 有 59% 及 58% 的同源性，它們之間有 60% 的同源性，CYP102A2 對不飽和脂肪酸和支鏈脂肪酸的羥化活性比對飽和脂肪酸的羥化活性高，尤其是對支鏈脂肪酸的羥化活性比 CYP102A1 要高，而 CYP102A3 的底物選擇性與 CYP102A2 相似，只是催化活性稍低[10]。CYP102A5 與 CYP102A1 有 60%的同源性，它可以催化長鏈脂肪酸的羥化，而且催化活性非常高。此外，CYP102A5 的區(qū)域選擇性比 CYP102A 家族其他成員更高。CYP102A7 與 CYP102A1 有 59% 的同源性，與其他成員不同，它對飽和脂肪酸的羥化活性比對不飽和及支鏈脂肪酸活性高，對環(huán)狀萜類也有較高的羥化活性[11]。

圖 1 青蒿素的生物合成

1.2 CYP152 家族成員的發(fā)現(xiàn)

CYP152A1 是一種單組分酶，可以利用 H2O2作為氧化劑，而不需要復(fù)雜的電子傳遞系統(tǒng)和昂貴的 NAD(P)H，有利于它的實際應(yīng)用。CYP152A1 是基于與 CYP152B1的序列相似性而在 B. subtilis 168 基因組序列中發(fā)現(xiàn)的[12]。與 CYP152B1 催化脂肪酸 α 位羥化不同，CYP152A1 催化飽和脂肪酸的 β 位羥化。它可能是?；念惪股睾铣赏緩街械囊粋€酶，因為這類抗生素中含有 β-羥基脂肪酸[13]?；谂c CYP152A1 的序列相似性，在厭氧菌Clostridium acetobutylicum ATCC 824 中發(fā)現(xiàn)了 CYP152A2。它與 CYP152A1 有 59% 的氨基酸序列同源性，可以利用H2O2為氧化劑，催化肉豆蔻酸 α 及 β 位的羥化[14]。

1.3 根據(jù)基因組序列分析發(fā)現(xiàn)新的 P450

在一些抗生素的生物合成基因簇中經(jīng)常包含一些 P450基因，催化其中某些重要的反應(yīng)步驟，如埃博霉素和柔紅霉素生物合成途徑中就有 P450 發(fā)揮作用。隨著生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，很多菌株已經(jīng)完成了全測序，利用在線軟件（Blast）分析基因組序列中的開放讀碼框，推測出基因組序列中包含的一些 P450 基因，這些基因編碼的酶的功能是未知的，需要表達這些基因，再通過一些高通量的篩選方法確定它們的底物和活性，這樣就確定了一個新的P450，它們的底物選擇性及功能都與已知的 P450 不同。Lamb 等[15]從全測序的 Streptomyces coelicolor A3(2) 中推測出了 18 個 P450 基因，其中鑒定出 CYP105D5 可以催化脂肪酸羥化。Sakaki 等分析 Streptomyces griseolus 的基因中的 P450 體系，包括 CYP105A1，通過在 Escherichia coli 中表達以后分析發(fā)現(xiàn)，CYP105A1 可以催化 VD2和VD3的 25 位羥化[16]。

1.4 我們的研究

我們根據(jù)分析基因組序列信息的方法，從新型抗腫瘤抗生素 Yatakemycin 的產(chǎn)生菌鏈霉菌 TP-A2060，生物農(nóng)藥金核霉素的產(chǎn)生菌鏈霉菌 Streptomyces 371 這兩個本實驗室進行全測序的鏈霉菌菌株中，分別發(fā)現(xiàn)了 19 和 18個 P450 基因，利用在線軟件分析這些 P450，把它們劃分到不同的 CYP 家族。然后利用分子生物學(xué)克隆表達方法，在大腸桿菌中表達得到可溶蛋白，確立了菌株中的P450 體系，并進一步研究他們的功能與活性。

2 P450 催化活性的篩選方法

根據(jù)上面的介紹可以發(fā)現(xiàn)，雖然通過分析基因組序列信息可以尋找到一些新的 P450 酶，但是有時只通過基因組序列信息本身還不能確定酶的底物和功能，就需要高效、合適的篩選方法與之配合才能鑒定得到新的 P450 氧化酶。根據(jù) P450 庫的大小和作為潛在底物的化合物的數(shù)量，有以下幾種篩選方法可以檢測 P450 的催化活性。

2.1 幾種高通量的篩選方法

目前通用的檢測方法是檢測 NAD(P)H、氧氣和過氧化物，這種方法適用于只檢測氧化活性而不考慮底物的類型。NAD(P)H 在 340 nm 有吸收，檢測隨著底物的氧化NAD(P)H 的消耗量，這種方法在酶的檢測實驗中經(jīng)常應(yīng)用[9]。Tsotsou 和他的同事建立了另一種方法：檢測NAD(P)+的產(chǎn)生量。這個方法是檢測堿溶液中 NAD(P)+在 360 nm 的吸收，雖然在強堿溶液中 NAD(P)+的消光系數(shù)幾乎和 NAD(P)H 是一樣的，對活性較低的酶來說檢測 NAD(P)+的產(chǎn)生量還是要比檢測 NAD(P)H 的消耗量可靠[17]。檢測氧氣也是一種有用的方法，氧傳感器已經(jīng)用于 P450 的底物篩選中了，這種商用微系統(tǒng)利用的原理是釕染料的熒光在有氧氣存在的條件下大幅淬滅[18]。另外，一些 P450 如 CYP152A1，利用過氧化物為氧化劑，可以利用比色法檢測。最近，Rabe 等[19]建立了一種檢測有機過氧化物的方法：以過氧化氫酶為指示酶，催化 Amplex Red 和有機過氧化物形成有熒光的化合物。

2.2 直接檢測反應(yīng)產(chǎn)物

與檢測 NAD(P)H、氧氣、過氧化物的方法相比，直接檢測氧化產(chǎn)物更可靠，可以減少假陽性結(jié)果。反應(yīng)如果產(chǎn)生有顏色的或者有熒光的產(chǎn)物，可以更容易檢測到活性。例如，有一類 P450 對吲哚有氧化活性，可以產(chǎn)生一些色素，如靛藍和靛玉紅[20]。

2.3 一類新的精確檢測的方法

高效液相色譜（HPLC）以及質(zhì)譜（MS）為 P450 的活性檢測提供了更通用而精確的方法。雖然與色譜法相比這些方法的通量較低，科學(xué)家也在努力提高質(zhì)譜法的檢測通量[21]。Tang 等[22]建立了一種利用 LC-MS 及同位素標記的方法確定 P450 底物的方法。他們篩選組織提取物作為P450 的內(nèi)源性底物：首先建立一個含有輔因子和組織提取物的 P450 反應(yīng)體系，并在體系內(nèi)以 1:1 的比例加入18O2/16O2，然后利用 LC-MS 檢測反應(yīng)體系中的有機提取物，最后用生物信息學(xué)工具分析，同位素標記的產(chǎn)物以M/M+2 雙峰的形式出現(xiàn)。傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FT-ICR/MS）具有極高的質(zhì)譜分辨率和精確度，對復(fù)雜的混合物可以直接進樣分析而不用先進行色譜分離，在底物分離試驗中引起了廣泛的興趣[23]。Furuya 建立了一種利用FT-ICR/MS 篩選單加氧酶底物的策略[24]，利用這種方法，他們發(fā)現(xiàn)了三個枯草桿菌 P450（CYP107J1、CYP109B1 和CYP134A1）和三個蠟狀芽孢桿菌 P450（CYP106、CYP107和 CYP109）。

2.4 篩選與檢測方法的應(yīng)用

圖 2 CYP199A2 催化的反應(yīng)

利用基因挖掘的方法可以找到更多新的 P450，高通量的質(zhì)譜檢測方法在對這些酶的底物進行大量篩選時會非常有用。尋找與篩選方法相結(jié)合，從基因庫中挖掘得到了一些全新的 P450，例如 CYP199A2 就可以催化一系列有趣的反應(yīng)。CYP199A2 在較早被報道對對位取代的苯甲酸有氧化活性，它是一類高效的芳香酸氧化酶[25]。而 Furuya和 Kino 在通過比色檢測法篩選約 100 個細菌 P450 對2-萘酸的羥化活性的時候發(fā)現(xiàn)，CYP199A2 是一個 2-萘酸單加氧酶。對反應(yīng)產(chǎn)物進行鑒定發(fā)現(xiàn)，CYP199A2 可以把2-萘酸氧化為 7 位或 8 位羥化的 2-萘酸，它也可以催化三種羥基 2-萘酸氧化為相應(yīng)的二羥基-2-萘酸，選擇性的氧化吲哚及喹啉酸[26]。圖 2 列舉了 CYP199A2 催化的一些反應(yīng)。

3 結(jié)論

利用基因組序列鑒定的 P450 基因形成了一個大的基因庫，作為新的生物氧化劑的來源引起了廣泛的關(guān)注。利用已知功能的 P450，如 CYP102A1 和 CYP152A1 的同源基因，可以挖掘出具有新的底物特異性和產(chǎn)物選擇性的酶。另外，一些 P450 家族的酶催化機制目前仍然是未知的。將來通過基因序列分析可以更快地獲得推定的 P450，但是單靠基因序列信息不能確定酶的底物，就需要利用一些高通量的分析方法，如質(zhì)譜法對這些酶的底物進行大規(guī)模的篩選。基因序列信息還可用于鑒定 P450 的氧化還原配體，這些配體又在對 P450 的催化活性進行優(yōu)化的過程中有重要影響。除了在體外篩選和鑒定酶的底物，鑒定和分析新發(fā)現(xiàn)的 P450 的晶體結(jié)構(gòu)不僅可以得到大量具有形形色色底物專一性的生物氧化酶，也可以獲得 P450 新的生化特征?；蛲诰虻姆椒ㄅc其他現(xiàn)有的及新的技術(shù)相結(jié)合，為生物催化氧化更廣泛的應(yīng)用提供了新的可能性。

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