李傳剛，高華琨，孫章萍，羅世華，楊 明，郝偉瑩，戚 婷，胡 云，李媛媛，舒曉宏，李墨林

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 泌尿外科,遼寧 大連 116027； 2.大連醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)08級(jí)學(xué)生，遼寧 大連 116044；3.大連醫(yī)科大學(xué) 藥物化學(xué)教研室，遼寧 大連 116044； 4.大連醫(yī)科大學(xué) 病理生理學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

順鉑(cisplatin，DDP)是臨床常用的治療實(shí)體腫瘤最有效的藥物之一,但DDP劑量依賴性的腎毒性作用極大限制了其療效的發(fā)揮。研究表明，DDP腎毒性的主要靶位是腎小管上皮，特別是近曲小管直部上皮細(xì)胞[1]，引起損傷局部缺血、缺氧、甚至灶狀壞死。DDP腎毒性損傷的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明,目前認(rèn)為可能與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)[2,3]。由于吡咯烷二硫氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)具有與金屬螯合的特性，可清除脂質(zhì)過氧化代謝中間產(chǎn)物以及抑制組織細(xì)胞中核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活及核移位，從而發(fā)揮抗炎性和抗氧化效應(yīng)[4]。因此，本課題前期研究將PDTC用于DDP腎毒性損傷的防治。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50 mg/kg PDTC能有效預(yù)防大劑量DDP所致的腎毒性損傷[5]，提示大劑量DDP所致的腎損傷可能不但與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，也可能與炎癥有關(guān)。同時(shí)，F(xiàn)aubel S[6]研究發(fā)現(xiàn)DDP所致腎毒性損傷的腎組織中IL-1β、IL-18和IL-6含量增高，并有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，但中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)在DDP所致腎損傷中作用至今尚不清楚。本研究在既往研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索PMN激活在大劑量DDP腎毒性損傷中的作用，為深入研究DDP腎毒性損傷的機(jī)制及其防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要藥品與試劑

注射用順鉑系江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品(30 mg/6 mL),產(chǎn)品批號(hào):091101。髓過氧化物酶(MPO)試劑盒系南京建成生物制品研究所產(chǎn)品。

1.2 動(dòng)物與處理

昆明種小鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量為28～33 g，平均(31.71±1.82)g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于室溫16～28℃，相對(duì)濕度40%～70%環(huán)境中，自由飲水和進(jìn)食。經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)后，依體重隨機(jī)分為4組：DDP用藥6 、24、48 h組和生理鹽水(NS)對(duì)照組，每組10只小鼠，性別和周齡相匹配。DDP針劑用生理鹽水配成1 mg/mL溶液，DDP用藥組小鼠腹腔注射DDP 0.12 mL/10 g體重，對(duì)照組小鼠腹腔內(nèi)注射等量NS。分別取對(duì)照組和DDP用藥后6、24、48 h組的小鼠，稱重后乙醚麻醉，內(nèi)眥靜脈取血、肝素抗凝，全自動(dòng)血細(xì)胞儀進(jìn)行白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)及分類，生化法檢測(cè)血尿素氮和肌酐含量。隨后，剖腹取小鼠兩側(cè)腎臟，制備10%腎皮質(zhì)勻漿，比色法測(cè)定血漿和腎組織勻漿中MPO的含量。

1.3 標(biāo)本的制備

1.3.1 血漿的制備：小鼠乙醚麻醉后，內(nèi)眥靜脈取血、肝素抗凝，全血，靜置后離心3000 r/min,10 min，血漿置4℃冰箱備用。

1.3.2 腎皮質(zhì)組織勻漿的制備：剖腹后迅速取出兩側(cè)腎臟，切下腎皮質(zhì)部分，每0.1 g 腎皮質(zhì)組織加入0.9 mL NS置玻璃勻漿器中反復(fù)研磨,制成10%的腎皮質(zhì)勻漿，離心3000 r/min，10 min，上清置4℃冰箱內(nèi)備用。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 外周血WBC和PMN計(jì)數(shù)：分別取對(duì)照組和DDP用藥后6、24、48 h的小鼠，乙醚吸入麻醉后內(nèi)眥靜脈取血、肝素抗凝，取少量抗凝血與等量肝素混合后全自動(dòng)血細(xì)胞儀進(jìn)行WBC胞計(jì)數(shù)和分類的檢測(cè)，了解DDP用藥前、后小鼠外周血WBC和PMN計(jì)數(shù)的變化。

血漿尿素氮(BUN)含量的測(cè)定:采用二乙酰一肟顯色法。分別將血漿、水或BUN標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(含0.005 mg氮/mL)與二乙酰-肟-氨硫脲(DAM- TSC液)及二酸(濃磷酸和濃硫酸)混合液混合后，置沸水中煮沸10 min，流水冷卻3 min，520 nm 波長(zhǎng)比色，以空白管調(diào)零,測(cè)各管的光密度值(A值)。利用下公式計(jì)算待測(cè)管血漿BUN含量(mmol/L)。

0.357×0.002×100/0.02

1.4.3 血漿肌酐(CRE)含量的測(cè)定:采用苦味酸沉淀蛋白法。 分別將血漿、水或肌酐標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(0.05 mg/dL)與堿性苦味酸混勻后，置37°C水浴30 min，510 nm波長(zhǎng)比色，以空白管調(diào)零，讀各管的A值，然后各管再加50%乙酸溶液兩滴，放置6 min后，再測(cè)各管的A值(A值’)。利用下公式計(jì)算待測(cè)管血肌酐含量(μmol/L)。

88.4×0.01/0.2×100

1.4.4 腎皮質(zhì)勻漿組織蛋白含量:采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量,蛋白標(biāo)準(zhǔn)液采用牛血清白蛋白(1 mg/mL)。取1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液倍比稀釋，比色法測(cè)A595 值并繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后取10%腎皮質(zhì)勻漿樣品，比色法測(cè)A595 值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量。

1.4.5 血漿和腎組織MPO含量的檢測(cè)：比色法檢測(cè)，采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的MPO試劑盒，按說明書要求進(jìn)行測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 DDP用藥后外周血WBC數(shù)量及分類的變化

DDP用藥后小鼠外周血WBC計(jì)數(shù)進(jìn)行性下降，DDP用藥后48 h，小鼠外周血WBC計(jì)數(shù)下降至(3.7±0.66)×109/L，與對(duì)照組小鼠(5.93±0.55)×109/L比較，差異具有顯著性意義(P<0.01)。DDP用藥后24 h內(nèi)，DDP用藥組小鼠外周血涂片可見中性粒細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象，無法進(jìn)行WBC分類；DDP用藥后48 h，外周血涂片未見明顯的中性粒細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象，此時(shí)，DDP用藥組小鼠PMN計(jì)數(shù)為(1.47±0.99) ×109/L，與對(duì)照組(1.44±0.84) ×109/L比較,差異無顯著性意義(P>0.05)。

2.2 DDP用藥后小鼠腎功能的變化

由表1可見，小鼠血BUN含量在DDP用藥24 h后進(jìn)行性升高,與對(duì)照組小鼠比較差異具有顯著性意義(P<0.01)；而小鼠血CRE含量較對(duì)照組小鼠增高出現(xiàn)在DDP用藥后48 h(P<0.01)。

表1 DDP用藥后小鼠腎功能的變化

1)與對(duì)照組相比，P<0.01

2.3 外周血MPO含量的變化

DDP用藥后小鼠外周血MPO含量的變化見圖1。由圖1可見，DDP用藥后24 h內(nèi)，小鼠外周血MPO含量較對(duì)照組略有降低，但差異無顯著性意義(P>0.05)；DDP用藥后48 h，小鼠血漿MPO含量升高達(dá)(39.58±4.04)U/L，與對(duì)照組(19.44±5.87)U/L比較，差異具有顯著性意義(P<0.01)。

2.4 腎皮質(zhì)勻漿組織蛋白含量

大劑量DDP用藥后6、24、48h腎皮質(zhì)勻漿中組織蛋白的含量分別為(9.35±1.67)、(10.58±0.94)、(8.63±2.78) mg/mL，與對(duì)照組腎皮質(zhì)勻漿中組織蛋白(9.67±1.99)mg/mL比較，差異無顯著性意義(P>0.05)。

圖1 DDP用藥后小鼠外周血MPO含量的變化

2.5 DDP用藥后腎皮質(zhì)勻漿MPO含量的變化

由圖2可見，大劑量DDP用藥后6 h，腎皮質(zhì)勻漿中MPO含量為(0.29±0.08)U/g，DDP用藥后24 h腎皮質(zhì)勻漿中MPO含量升至(0.34±0.11)U/g，與對(duì)照組小鼠(0.13±0.03)U/g比較，差異具有顯著性意義(P<0.01)；但DDP用藥后48 h，腎皮質(zhì)勻漿MPO含量降至(0.16±0.02)U/g，與對(duì)照組差異無顯著性意義(P>0.05)。

圖2 DDP用藥后小鼠腎組織MPO含量的變化

3 討 論

急性腎功能衰竭是腎臟本身或腎外原因引起腎臟泌尿功能急劇降低,以致機(jī)體內(nèi)環(huán)境出現(xiàn)嚴(yán)重紊亂的臨床綜合征，是臨床常見的危重病理生理過程。目前臨床多采用水化利尿的方法來減少DDP腎毒性的發(fā)生，但統(tǒng)計(jì)顯示，臨床順鉑(DDP)化療腎損害發(fā)生率仍高達(dá)25%～35%[7]，提示DDP腎毒性損傷的機(jī)制仍有待于進(jìn)一步探索。

中性粒細(xì)胞(neutrophil)是體內(nèi)數(shù)量最多的炎性細(xì)胞,來源于骨髓，釋放后在血流中僅數(shù)小時(shí)便移出血管，具有很強(qiáng)的趨化、變形、粘附、吞噬和殺菌作用,在機(jī)體抗感染的病理過程中起非常重要的作用[8]。正常情況下，循環(huán)中的PMN處于非活化狀態(tài)，必須在化學(xué)趨化因子或激活劑作用下粘附于內(nèi)皮細(xì)胞表面活化，趨化PMN的化學(xué)因子有兩類：一類是自身組織損傷釋放的因子，如膠原和纖維蛋白片段、補(bǔ)體活化產(chǎn)物及免疫細(xì)胞因子等；另一類是微生物來源的含有N-早酰蛋氨酸殘基的多肽。受趨化因子作用后，PMN表面的L-選擇素(selectin)數(shù)量增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞開始表達(dá)P-或E-選擇素，這兩類選擇素結(jié)合啟動(dòng)了PMN與內(nèi)皮細(xì)胞粘附。隨后，PMN迅速表達(dá)整合素(intergrin)，例如MAC-1和LFA-1等，與內(nèi)皮細(xì)胞的配體結(jié)合可使PMN變扁，緊密粘貼內(nèi)皮細(xì)胞。繼而，PMN變形移出血管外向炎性或受損組織中浸潤(rùn)，活化的PMN脫顆?；蛲ㄟ^呼吸爆發(fā)生成大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS) 和其他炎癥介質(zhì),參與機(jī)體對(duì)病原微生物的殺滅和清除，甚至引起組織損傷。目前研究表明，PMN產(chǎn)生ROS 的過程主要依賴于還原型輔酶Ⅱ(NADPH)、MPO氧化酶系統(tǒng)。其中，MPO 是PMN嗜天青顆粒釋放的過氧化物酶類,是PMN聚集的特征酶,是PMN脫顆粒的標(biāo)志，其主要催化H2O2與Cl-起化學(xué)反應(yīng),產(chǎn)生次氯酸,后者具有很強(qiáng)的抗微生物活性[9]。Bradley 等[10]研究表明,MPO 的表達(dá)水平與PMN計(jì)數(shù)之間存在極顯著相關(guān)性,并可作為PMN的功能標(biāo)志。

本研究利用單一劑量DDP(12 mg/Kg)腹腔內(nèi)注射制備小鼠急性腎損傷的動(dòng)物模型[5]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DDP用藥后48 h小鼠血BUN和CRE含量明顯增高，與對(duì)照組小鼠比較差異具有顯著性意義(P<0.01)，提示DDP用藥后48 h小鼠出現(xiàn)急性腎功能衰竭。

通過檢測(cè)大劑量DDP用藥后48 h 內(nèi)小鼠外周血WBC、PMN計(jì)數(shù)和PMN釋放的MPO含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：DDP用藥后24 h內(nèi)，伴隨外周血WBC計(jì)數(shù)的降低，血MPO含量也逐漸下降，外周血WBC計(jì)數(shù)的下降與血MPO含量的降低相一致；同時(shí)，小鼠外周血涂片檢查發(fā)現(xiàn)：DDP用藥后24 h內(nèi)小鼠外周血存在中性粒細(xì)脫顆?，F(xiàn)象。DDP用藥后48 h，DDP用藥組小鼠外周血WBC計(jì)數(shù)繼續(xù)下降，與對(duì)照組比較差異有顯著性意義(P<0.01)，但小鼠外周血涂片檢查未見明顯的PMN脫顆?，F(xiàn)象，兩組小鼠外周血PMN計(jì)數(shù)比較差異卻無顯著性意義(P>0.05)；此時(shí)，DDP用藥組小鼠血MPO含量明顯高于對(duì)照組小鼠，差異均具有顯著性意義(P<0.01)。由于MPO存在于PMN的嗜天青顆粒中，PMN激活時(shí)可釋放MPO，從而使外周血MPO含量增加。本研究發(fā)現(xiàn)，DDP用藥組小鼠外周血MPO活性升高出現(xiàn)的時(shí)間與大劑量DDP用藥后小鼠急性腎功能衰竭出現(xiàn)的時(shí)間相吻合，提示大劑量DDP所致小鼠腎損害可能與PMN激活、大量釋放MPO有關(guān)。通過檢測(cè)10%腎皮質(zhì)勻漿中的MPO含量，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：DDP用藥后6 h 小鼠腎皮質(zhì)勻漿MPO含量明顯升高，DDP用藥后24 h 達(dá)高峰，為(0.34±0.11)U/g，與對(duì)照組小鼠(0.13±0.03)U/g 比較，差異具有顯著性意義(P<0.01)；DDP用藥后48 h腎皮質(zhì)勻漿MPO含量下降，與對(duì)照組比較差異無顯著性意義(P>0.05)。大劑量DDP用藥后24 h內(nèi)腎皮質(zhì)勻漿MPO活性增高,提示大劑量DDP所致小鼠腎毒性損害早期，小鼠腎組織內(nèi)存在PMN活化、脫顆粒并釋放MPO。由于MPO可將H2O2與Cl-轉(zhuǎn)為次氯酸,而次氯酸是強(qiáng)氧化劑，可氧化巰基，使氨基酸和蛋白質(zhì)降解，從而造成腎組織細(xì)胞損傷。因此，DDP所致的急性腎損害可能與PMN釋放髓過氧化物酶有關(guān)。

綜上所述，大劑量DDP用藥后24 h內(nèi)小鼠外周血WBC數(shù)量明顯下降。但外周血涂片可見PMN脫顆粒、腎皮質(zhì)勻漿中MPO含量明顯升高，考慮可能與DDP用藥后PMN活化、聚集至腎臟、并大量釋放MPO，引起腎損傷，最終導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)急性腎功能衰竭。因此，大劑量DDP所致小鼠腎損害與PMN在腎皮質(zhì)內(nèi)的激活、釋放有關(guān)，研究并開發(fā)抑制PMN活化的方法和措施，應(yīng)有助于DDP腎損傷的防治。

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