齊 巖，樸豐源

(1.大連醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 大連 116011； 2.大連醫(yī)科大學 勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生教研室，遼寧 大連 116044)

地方性砷中毒是世界性公共衛(wèi)生問題之一。其中，砷對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用已引起人們的高度關注。流行病學調查顯示，高砷地區(qū)的兒童智商平均水平明顯低于對照組[1]。動物實驗表明，砷可以通過血腦屏障進入腦實質，慢性砷暴露的豚鼠和大鼠腦中砷濃度與暴露劑量呈顯著正相關[2]。Rodriguez等[2]用雄性SD大鼠經(jīng)口灌胃染砷2～4周后，觀察到大鼠運動減少，在自我中心任務的行為測試中錯誤次數(shù)增多，延遲交替任務出現(xiàn)大量錯誤。這些神經(jīng)行為學異常變化的結果,提示了中樞神經(jīng)系統(tǒng)是砷毒性作用的敏感靶器官，但其作用機制尚不清楚。

Jarid1c是Jarid性基因家族成員之一，屬于X染色體基因，攜帶雌性遺傳信息，主要參與神經(jīng)細胞的轉錄調控、染色質重塑和軸索發(fā)育。腦是Jarid家族基因表達的主要器官，Jarid1c突變可導致智力發(fā)育障礙[3]。因此，Jarid家族基因的功能可能與智力發(fā)育調控密切相關。

本研究用基因芯片和RT-PCR技術，檢測了不同劑量亞慢性染砷小鼠的腦組織Jarid家族基因的表達，解析砷對這些基因表達的影響，為探討砷的神經(jīng)毒性機制提供新的研究思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

TRIzol 試劑盒(Invitrogen公司)；RNeasy Mini Kit (OIAGEN公司)；DEPC-Water (Ambion公司); Herring Sperm DNA (Promega公司); BSA (Invitrogen公司); MOPS (Sagon公司); β-Mercaptoethanol (Sagon公司); Normal Goat IgG (Sigma公司)；氯仿；異丙醇；乙醇；Quant cDNA 第1鏈合成試劑盒；2×Taq PCR MasterMix; 瓊脂糖; EDTA-2Na; 硼酸。

1.2 設 備

GeneArrayTM掃描儀3000 (Affymetrix公司)、全自動芯片洗滌工作站450 (Affymetrix公司)、基因芯片雜交箱640 (Affymetrix公司)、Microarray Suite Version 5.0分析軟件 (Affymetrix公司)等； 紫外分光光度計; PCR擴增儀；UVP凝膠電泳拍攝分析系統(tǒng)(美國UVP公司)。

1.2 實驗動物及處理

健康昆明種小鼠30只，體重(20±2)g，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供。按體重將小鼠隨機分為3組，即生理鹽水對照組、低劑量組(1 mg/L As2O3染砷組)和高劑量組(4 mg/L As2O3染砷組)。每組10只，小鼠正常飲食，連續(xù)染砷60 d。染毒結束后，將小鼠斷頭處死并立即取腦儲存于RNA lazer 液中，低溫保存。

1.3 總RNA的提取和基因芯片雜交

分別將各實驗組和對照組的小鼠大腦和小腦在液氮中進行研磨，依TRIzol 試劑盒操作說明從腦組織中抽提總RNA，用RNeasy Mini Kit進行純化。提取的RNA在紫外分光光度儀下測定RNA的濃度和純度，同時變性膠電泳檢測RNA有無降解；然后反轉錄成cDNA，用RNA轉錄標記試劑盒進行體外轉錄合成cRNA探針，合成的同時進行生物素標記；生物素標記的cRNA探針經(jīng)片段化處理后與Mouse Genome 430 2.0 Araay基因芯片在雜交箱640中45℃雜交16 h，然后于全自動芯片洗滌工作站450中洗脫、染色；最后用GeneArrayTM 掃描儀3000掃描雜交信號。

1.4 芯片數(shù)據(jù)處理和生物學信息分析

雜交結果用Affymetrix公司的Microarray Suite Version 5.0軟件進行分析。在對單個樣本表達分析的前提下，根據(jù)P<0.04為表達，0.04～0.06為臨界，P>0.06為不表達，分別建立對照組、低劑量組，高劑量組小腦組織的基因表達譜；然后將二者的基因表達譜進行比較，根據(jù)signal log ratio (SLR)值判斷。SLR>1(即表達倍數(shù)>21)為表達上調，SLR<-1(即表達倍數(shù)<2-1)為表達下調。篩選得到在對照組、低劑量組，高劑量組中差異表達的基因探針號輸入NetAffy網(wǎng)站 (www.affymetrix.com)中進行批量處理查詢 (Batch Query)，查詢出相對應的基因和生物學信息。

1.5 RT-PCR檢測方法

按試劑盒說明提取總RNA，RT-PCR反應條件，Jarid1d：94 ℃變性3 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，72 ℃充分延伸7 min。β-actin ：94 ℃變性3 min,94℃變性30 s,58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，72 ℃充分延伸7 min。RT-PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)照相，并同β-actin結果比較。引物設計見表1。

表1 引物設計

1.6 統(tǒng)計學方法

用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行分析,用方差和LSD檢驗分析PCR檢測的mRNA表達相對值(輝度值)的多組間差異,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 染砷小鼠腦組織Jarid1d表達的基因芯片分析

與對照組比較，低劑量組和高劑量組小鼠大腦組織Jarid1d基因表達分別為29.9和34.3倍，小腦組織分別為9.2和13.9倍，均顯著上調(表達倍數(shù)>2)(表2)。

表2 染砷小鼠腦組織Jarid1d表達的基因芯片結果

2.2 染砷小鼠大腦皮質Jarid1d表達的RT-PCR檢測

就Jarid1d基因表達，用RT-PCR做了進一步驗證檢測。如圖1所示，高劑量染砷組大腦皮質Jarid1d的表達明顯高于對照組和低劑量染砷組(P<0.05)。β-actin表達差異無顯著性意義。

圖1 染砷小鼠大腦皮質Jarid1d差異表達的RT-PCR結果

2.3 染砷小鼠大腦髓質Jarid1d表達的RT-PCR檢測

如圖2所示，RT-PCR的驗證檢測結果表明，高劑量染砷組大腦髓質Jarid1d的表達顯著高于對照組和低劑量染砷組(P<0.01)。β-actin表達差異無顯著性意義。

圖2 染砷小鼠大腦髓質Jarid1d差異表達的RT-PCR結果

2.4 染砷小鼠小腦Jarid1d表達的RT-PCR檢測

如圖3所示，RT-PCR的驗證檢測結果表明，高劑量染砷組小腦組織Jarid1d的表達顯著高于對照組和低劑量染砷組(P<0.01)。β-actin表達差異無顯著性意義。

圖3 染砷小鼠小腦Jarid1d差異表達的RT-PCR結果

3 討 論

流行病調查和動物試驗研究已經(jīng)證明，砷是一種具有神經(jīng)毒性的化學物，當人和動物被暴露時可影響腦的學習和記憶功能[1,5]。腦是一個結構和功能最為復雜敏感的器官，其學習記憶功能受包括神經(jīng)遞質在內(nèi)的體內(nèi)諸多因素的調控。當這些調控過程受到某些因素的干擾時，會影響腦的正常學習記憶功能，導致智力低下。

有文獻報道，Jarid1c參與調節(jié)腦的學習記憶功能等多種生物學過程[3]。Xu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，Jarid家族基因在腦中大量表達，參與調節(jié)腦的功能。這些文獻表明，任何能使Jarid家族的基因或蛋白在腦中的正常表達受到影響的因素，都可能導致神經(jīng)行為的異常表現(xiàn)。本研究的基因芯片篩選結果顯示，亞慢性染砷沒有引起Jarid1c在小鼠腦組織的異常表達。相反，砷導致Jarid家族的另一個基因Jarid1d在腦組織顯著上調。即與對照組比較，低劑量組和高劑量組的小鼠大腦中Jarid1d表達分別為29.9和34.3倍，小腦中分別為9.2和13.9倍。這一結果，引起本課題組的極大興趣。所以用RT-PCR技術做了進一步的驗證實驗。發(fā)現(xiàn)高劑量染砷組小鼠大腦皮質、髓質及小腦組織中Jarid1d的mRNA表達均高于對照組，與基因芯片的結果相吻合。這些結果提示，亞慢性染砷可明顯上調Jarid1d在小鼠腦組織的表達。Jarid1d和Jarid1c為同一家族的兩個成員，是一種與Jarid1c對等的Y染色體性基因，攜帶雄性遺傳性狀信息，被認為具有與Jarid1c基本相同的功能[6]。因此，亞慢性染砷對Jarid1d在腦組織表達的影響應該引起關注。

亞慢性砷暴露可影響小鼠腦組織Jarid1d基因的表達，提示Jarid1d可能是砷的神經(jīng)毒作用靶基因。今后進一步從蛋白質水平驗證亞慢性染砷對腦組織Jarid1d表達的影響，同時通過一系列干預實驗探討砷對小鼠腦組織Jarid1d基因表達的影響與小鼠學習記憶及行為功能異常之間的因果關系是非常必要的。

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[2] Rodríguez VM,Carrizales L,Jiménez-Capdeville ME,et al.The effects of sodium arsenite exposure on behavioral parameters in the rat[J].Brain Res Bull,2001,55(2):301-308.

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[5] Wang Y,Li S,Piao F,et al.Subchronic exposure to arsenic downregulated the expression of Camk4 as an important gene related to the late phase of cerebellar LTD of mice[J].Neurotoxicol Teratol,2009,31(5):318-322.

[6] Xu J,Deng X.Disteche CM.Sex-specific expression of the X-linked histone demethylase gene Jarid1c in brain[J].PLoS ONE,2008，3(7):e2553.