蔣樹

(國家農(nóng)副加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，安徽國家農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化與監(jiān)測中心，合肥 230051)

近20年來，獸藥(包括飼料藥物添加劑)在畜牧業(yè)中的應(yīng)用日益廣泛，而動物性食品中的獸藥殘留問題也逐漸成為人們關(guān)注的社會焦點(diǎn)。目前非法使用違禁藥物、濫用抗菌藥和藥物添加劑等是造成我國動物源性食品中獸藥殘留超標(biāo)，引起畜禽產(chǎn)品消費(fèi)安全和食品貿(mào)易爭端的主要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約有70%～80%的食品動物，在其一生中或多或少服用過藥物[1]。隨著人們對食品與環(huán)境質(zhì)量要求的不斷提高，飼料中抗生素的添加所引起的問題愈來愈引起人們的關(guān)注。

硝呋烯腙(Nitrovin)是一種抗生素，能夠促進(jìn)動物生長,它通過增加動物腸道粘膜的通透性，從而能有效地提高營養(yǎng)物質(zhì)在動物消化道中的消化和吸收；硝呋烯腙還能有效抑制動物消化道內(nèi)病原微生物對葡萄糖的利用，使其新陳代謝過程受阻，從而抑制和殺滅多種瘸原微生物，減少動物感染疾病的機(jī)會，提高抗病能力[2]，因此硝呋烯腙在畜禽養(yǎng)殖方面有一定的應(yīng)用[3-6]。由于硝呋烯腙對人體會造成潛在的危害，所以我國農(nóng)業(yè)部235號公告中將其作為違禁藥物，在所有動物源性食品中不得檢出。

目前，有關(guān)動物源性食品中硝呋烯腙殘留量測定方法的研究只有少量文獻(xiàn)報(bào)道[7,8]，國家也尚未制定相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)，因此建立動物源性食品硝呋烯腙殘留量的快速、靈敏的檢測方法尤為重要。為此筆者對液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源性食品中硝呋烯腙的殘留量進(jìn)行了研究，這既可以為執(zhí)法監(jiān)管機(jī)構(gòu)提供技術(shù)支持，又可以為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：6410 Triple Quad LC/MS型，美國安捷倫公司；

去離子水發(fā)生器：Milli-Q型，美國Millipore公司；

硝呋烯腙標(biāo)準(zhǔn)品：德國Dr.公司；

乙腈、乙酸、甲酸 ：色譜純，美國TEDIA公司；

有機(jī)微孔過濾膜：孔徑0.22 μm；

硝呋烯腙標(biāo)準(zhǔn)儲備液：100 mg/L，準(zhǔn)確稱取10.0 mg硝呋烯腙標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，使用時(shí)根據(jù)需要用流動相稀釋成合適標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配；

實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q去離子高純水。

1.2 儀器分析條件

(1)液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18卡套柱( 30 mm×2.1 mm，1.8 μm)或相當(dāng)者；柱溫：35℃；流速：0.20 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動相：0.05%甲酸-甲醇(體積比1∶1)，等度洗脫。

(2)質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI+)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：11 L/min；霧化器壓力：276 kPa(40 psi)；毛細(xì)管電壓：3 500 V；硝呋烯腙最佳的碰撞電壓、碰撞能量以及相應(yīng)的定性離子對和定量離子對見表1。

表 1 多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)條件

1.3 樣品處理方法

稱取5.0 g(精確到0.01 g)試樣于50 mL聚丙

烯離心管中，加入25.0 mL提取液，勻漿1 min，漩渦混勻1 min，超聲提取10 min，以10 000 r/min離心5 min(溫度5℃)，取上清液。重復(fù)提取一次，合并兩次上清液。合并的上清液于45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用3 mL水溶液(含2%二甲基甲酰胺+1%甲醇)溶解后作為待凈化液。將待凈化液以不超過1 mL/min的速度過Agilent SampliQ OPT固相萃取柱(50 mg， 3 mL，使用前分別用6 mL甲醇和6 mL水活化)，棄去濾液。用3 mL 5%甲醇水溶液淋洗，棄去淋洗液，將小柱抽干，再用5 mL甲醇溶液(含5%二甲基甲酰胺)洗脫并收集洗脫液。將洗脫液于45℃下用氮?dú)獯蹈?，? mL流動相定容，漩渦混勻后過0.22 μm濾膜，然后用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的選擇

考察了硝呋烯腙在3種不同類型的色譜柱Agilent Eclipse XDB C18( 150 mm× 4. 6 mm，5.0 μm)、ZORBAX Extend-C18( 100 mm× 2.1 mm，3.5 μm)和ZORBAX SB-C18卡套柱( 30 mm×2.1 mm，1.8 μm)上的保留時(shí)間、峰型及響應(yīng)。同時(shí)考察了2.0、5.0、10.0 mmol/L乙酸銨-乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.1%甲酸-甲醇等流動相體系和流速。Eclipse XDB C18分析柱由于柱內(nèi)徑及填料粒徑大，不適用于質(zhì)譜系統(tǒng)低流速進(jìn)樣分析，且出峰時(shí)間偏長，峰寬過大。ZORBAX Extend-C18適用于較寬的pH值范圍，尤其適用于堿性pH值范圍的目標(biāo)物的分析。最終選用了0.1%甲酸-甲醇流動相體系，和 ZORBAX SB-C18卡套柱(30 mm×2.1 mm，1.8 μm)。ZORBAX SB-C18卡套柱較適合在偏酸性條件下工作，該色譜柱1.8 μm填料，柱長僅為30 mm，分析速度快，硝呋烯腙的保留時(shí)間在0.8 min左右，包括進(jìn)樣時(shí)間和平衡色譜柱時(shí)間在內(nèi)每個(gè)樣品分析耗時(shí)僅需3.0 min。該方法與普通的HPLC/MS/MS方法相比，可大大節(jié)省分析時(shí)間，且與串聯(lián)質(zhì)譜完美連接，不存在分流問題。

硝呋烯腙化合物中含有N元素，通過比較，它在正離子模下響應(yīng)更好。在流動相中加入甲酸能增加硝呋烯腙在正離子(ESI+)模式下的離子化效率。因此分別在流動相中加入0.05%甲酸或5 mmol/L乙酸銨，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在加入甲酸后，硝呋烯腙標(biāo)準(zhǔn)溶液峰形和響應(yīng)均優(yōu)于乙酸銨。甲酸濃度為0.05%時(shí)，響應(yīng)值最高。比較甲酸-甲醇體系與甲酸-乙腈體系時(shí)，發(fā)現(xiàn)甲酸-甲醇體系出峰時(shí)間略晚于甲酸-乙腈體系，但在靈敏度方面與甲酸-乙腈體系無顯著性差異?？紤]到流動相的經(jīng)濟(jì)性和環(huán)保性，實(shí)驗(yàn)最終選用了毒性較低且價(jià)格便宜的甲酸-甲醇體系。當(dāng)0.05%甲酸與甲醇的體積比為50∶50時(shí)，峰形和響應(yīng)值均較好。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

參照CAC和EU第657/2002 /EEC號決議中有關(guān)規(guī)定[9]，選擇兩對離子進(jìn)行MRM監(jiān)測，其中母離子和子離子要按照每種化合物的質(zhì)譜圖和結(jié)構(gòu)特性選取，并且在實(shí)際樣品分析中基質(zhì)干擾較少。

液相色譜以0.2 mL/min的流速，將10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液引入離子源，分別在正負(fù)離子模式下進(jìn)行工作，發(fā)現(xiàn)該化合物適合正離子模式。這是由于該化合物中含有N原子，更易于結(jié)合H+。圖1為硝呋烯腙的一級全掃描質(zhì)譜圖，利用一級質(zhì)譜全掃描分析目標(biāo)化合物的分子離子峰，選取m/z361.2為母離子,再以10 mg/L硝呋烯腙標(biāo)準(zhǔn)溶液對質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，以獲得最佳的質(zhì)譜條件。分別在90、100、110、120 V的碰撞電壓下對硝呋烯腙的母離子進(jìn)行選擇性監(jiān)測，比較不同碰撞電壓下母離子的強(qiáng)度，確定硝呋烯腙的最佳解離電壓為110 V。然后在110 V的碰撞電壓下，比較不同碰撞能量對子離子的影響，最終確定m/z222.1和m/z58.0為定量及定性離子，優(yōu)化后的多反應(yīng)監(jiān)測條件見表1。

圖1 硝呋烯腙的一級全掃描質(zhì)譜圖

2.3 提取溶劑及凈化柱的選擇

分別使用Agilent SampliQ OPT聚合物固相萃取小柱(SPE)和VARIAN BOND ELUT PLEXA PCX固相萃取小柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCX SPE柱對目標(biāo)物硝呋烯腙的保留效果不好，直接影響了最終的回收率。SampliQ OPT SPE對樣品進(jìn)行凈化，可有效去除雜質(zhì)，方法檢出限較低，適合動物源性食品中硝呋烯腙提取液的凈化且成本較低。

研究了乙腈(ACN)、二甲基甲酰胺(DMF)、ACN-DMF、ACN-DMF-2%氨水對硝呋烯腙的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACN-DMF-2%氨水混合體系提取效果明顯優(yōu)于其它3種提取液，最終選擇此混合體系作為提取溶液?？疾炝薉MF在體系中體積比的變化對回收率的影響，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，當(dāng)DMF在體系中的體積分?jǐn)?shù)約為40%時(shí)，回收率最高，這是由于硝呋烯腙在DMF中有更好的溶解度。

圖2 DMF含量對回收率的影響

氨水含量對回收率的影響見圖3。由于硝呋烯腙可能在動物組織中與蛋白質(zhì)等物質(zhì)結(jié)合緊密，不易于提取，而隨著氨水的加入，體系pH值升高，削弱了硝呋烯腙與組織間的結(jié)合力，提取效果增強(qiáng)，提高了回收率。通過比較，最終選擇2%的氨水進(jìn)行萃取。

圖3 氨水的含量對回收率的影響

取標(biāo)準(zhǔn)溶液過固相柱，分別用純水以及5%、10%、15%的甲醇水溶液作為淋洗液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在純水和5%甲醇水溶液中未發(fā)現(xiàn)硝呋烯腙;而10%和15%甲醇水溶液中有少量硝呋烯腙損失，且隨著甲醇含量的增加，硝呋烯腙的損失增加。這說明硝呋烯腙的極性可能與甲醇相似，當(dāng)甲醇的含量為10%時(shí)，硝呋烯腙能溶于其中而隨其流失。純水洗滌能力低于5%甲醇水溶液，不能洗去部分雜質(zhì)，因此選用5%甲醇水溶液作為淋洗液。

移取標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用6 mL的甲醇、乙腈和乙酸乙酯作為洗脫液，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯的洗脫能力最差；而乙腈和甲醇洗脫后，硝呋烯腙的回收率均約為98%，本實(shí)驗(yàn)選用甲醇作為洗脫溶液。

2.4 線性方程與檢出限

在優(yōu)化的測定條件下，配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定。以目標(biāo)物定量離子的峰面積(Y)對硝呋烯腙濃度(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在1.0～100.0 μg/L范圍內(nèi)，硝呋烯腙的質(zhì)量濃度和定量離子的峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=4 279.99+2 107.44X，r2=0.999 5。方法檢出限( LOD)是以空白樣品添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，經(jīng)前處理后上機(jī)測定，以信噪比S/N= 3時(shí)對應(yīng)的最低出峰濃度為檢出濃度，并依據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算得出。經(jīng)計(jì)算硝呋烯腙的檢出限為2 μg/kg。

2.5 回收率和精密度試驗(yàn)

采用在空白陰性樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，分別對硝呋烯腙進(jìn)行3個(gè)水平的添加回收試驗(yàn)，每個(gè)水平進(jìn)行 5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)?；厥章试囼?yàn)結(jié)果列于表2。由表2可知，硝呋烯腙的回收率為66%～82%，回收率結(jié)果比較滿意。

表2 回收試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

用添加水平為10 μg /kg樣品重復(fù)試驗(yàn)5次，計(jì)算得到日內(nèi)精密度；連續(xù)5天重復(fù)取樣測定日間精密度，試驗(yàn)結(jié)果列于表3。由表3可知，方法的重現(xiàn)性在可接受的范圍內(nèi)(RSD<15%)。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 實(shí)際樣品分析

在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的檢測步驟和儀器條件下，對當(dāng)前日常檢測的樣品和市場抽查的豬肉(12例)、雞肉(10例)樣品進(jìn)行了測定，檢出1例豬肉樣品中含有硝呋烯腙殘留。

3 結(jié)語

建立了動物源性食品中硝呋烯腙殘留量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，該方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確和操作簡單的特點(diǎn)。方法檢出限為2 μg/kg，能滿足動物源性食品中硝呋烯腙低殘留的檢測要求，也為今后制定相關(guān)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)提供了參考依據(jù)。

[1] 龐國芳，方曉明，余建新，等.農(nóng)藥獸藥殘留分析技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2007：14.

[2] 陳永豐,印遇龍，譚支良，等.硝呋烯腙對斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響[J].中國畜牧雜志，2003，39(3): 29-30.

[3] 劉金松，楊彩梅，陳安國，等. 硝呋烯腙在畜禽飼料中的應(yīng)用效果及特點(diǎn)[J].飼料研究,1999(11):32-33.

[4] 李彥鋒.硝呋烯腙在動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2008(2): 88.

[5] 孟慶利,胡文琴，劉鐵錚,等.硝呋烯腙在養(yǎng)雞生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].中國禽業(yè)導(dǎo)刊，2004(3): 41.

[6] 許福來.硝呋烯腙概述[J].畜禽業(yè)，2002(6): 20-21.

[7] 王金榮，李德發(fā)，張麗英，等. 硝呋烯腙的純化及其在飼料中的HPLC及LC-MS檢測技術(shù)研究[J].分析測試學(xué)報(bào)，2006,26(增刊):99-100.

[8] Lin S Y，Jeng S L.High-performance liquid chromatographic determination of carbadox, olaquindox, furazolidone, nitrofurazone, and nitrovin in feed. Journal of Food Protection[J].2001,64(8):1 231-1 234.

[9] European Union( 2002 /657 /EC) Official Journal of the European Union[J].2002，221/8，EN.