王建華 李 立 郭 翠

(1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局食品農(nóng)產(chǎn)品檢測中心，青島 266002； 2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100025；3.濟(jì)寧出入境檢驗(yàn)檢疫局, 濟(jì)寧 272100)

我國是世界上農(nóng)田雜草發(fā)生最嚴(yán)重的國家之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年因雜草危害給經(jīng)濟(jì)作物造成的損失約80億元。近年來，中國農(nóng)藥工業(yè)發(fā)展十分迅速，農(nóng)藥品種成倍增長，而除草劑產(chǎn)業(yè)發(fā)展的增速遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于殺蟲劑和殺菌劑，目前產(chǎn)量已占農(nóng)藥總產(chǎn)量的1/3[1]。乙草胺、丁草胺、甲草胺均屬于酰胺類除草劑，在我國普遍使用。近年來，日本在松茸和大?；ㄉ邪l(fā)現(xiàn)乙草胺檢出超標(biāo)。該類除草劑的作用機(jī)制是抑制雜草細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成[2]，對動(dòng)物和人的急性毒性較小[3]，但近年來卻發(fā)現(xiàn)乙草胺、丁草胺具有弱的基因毒性[4]，使得酰胺類除草劑的殘留檢測問題備受關(guān)注。

山東檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心作為能力驗(yàn)證提供者，開展了3種酰胺類除草劑測定的候選標(biāo)準(zhǔn)樣品研制(以下稱標(biāo)準(zhǔn)樣品)，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證后，將形成標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，這對于新建立檢測方法的確證、日常檢測工作的質(zhì)量保證和質(zhì)量控制具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜儀:7890-5975C型，配自動(dòng)進(jìn)樣器，分流/不分流進(jìn)樣口，美國Agilent公司；

具塞塑料離心管：50 mL；

冷凍離心機(jī)：5810型， 德國Eppendorf 公司；

旋渦混合器、數(shù)顯型水平振蕩器：德國IKA公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R-215型，瑞士Buchi公司；

移液器：0.2、1.0、5 mL，法國Gilson公司；

乙草胺、丁草胺、甲草胺、異丙甲草胺除草劑純標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：均購自美國Sigma公司；

乙腈、丙酮、正己烷:色譜純,美國Burdick & Jackson公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

稱取商品化濃縮白菜汁5 kg，通過計(jì)算需添加濃度為25 mg/L的3種除草劑混標(biāo)溶液約30 mL，使得制成的標(biāo)準(zhǔn)樣品中除草劑含量約為150 μg/kg。由于濃縮白菜汁較粘稠，加標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)應(yīng)不斷攪拌，并分多次添加。用磁力攪拌器攪拌約96 h，經(jīng)測定上、中、下層樣品除草劑含量值基本一致后，分裝于50 mL塑料離心管，每瓶約40 mL共100瓶。

1.3 除草劑含量的測定

(1)測定方法

參考筆者已經(jīng)驗(yàn)證的檢測方法[5，6]：稱取1.2中制備的白菜汁標(biāo)準(zhǔn)樣品2.00 g于50 mL離心管，加入10 mL水、5 mL磷酸鹽緩沖溶液、20 mL乙腈、約2 g氯化鈉，水平振蕩10 min，4℃下以5 000 r/min離心10 min，取上清液10 mL于梨形瓶，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近1 mL。用SAX/PSA固相萃取柱凈化[提前用5 mL丙酮-正己烷(體積比3∶7，下同)混和溶劑活化]，然后用20 mL丙酮-正己烷混和溶劑洗脫，濃縮后用丙酮-正己烷混和溶劑定容至1 mL，待GC-MS-SIM分析測定。

(2)GC-MS測定條件

色譜柱：HP-5 MS柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)；載氣：氦氣；恒壓模式136 kPa；柱溫程序：初始溫度70℃，保持4.0 min，以25 ℃/min升至150℃，以3℃/min升至200℃，再以8℃/min升至280℃，

保持10.0 min；離子源溫度：150℃；四極桿溫度：230℃；色譜-質(zhì)譜接口溫度：280℃；EI源電子能量：70 eV；SIM測定。

2 均勻性與穩(wěn)定性檢驗(yàn)

2.1 均勻性檢驗(yàn)

將分裝的100瓶樣品隨機(jī)分為10組，每組10瓶，每組任取1瓶平行2份進(jìn)行測定，測定結(jié)果采用單因子方差統(tǒng)計(jì)分析[7]進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)，即抽取i個(gè)樣品(i=1、2、……m)，每個(gè)樣在重復(fù)條件下測試j次(j=1、2、……n)。計(jì)算樣品間平方和、樣品內(nèi)平方和以及自由度，從而計(jì)算統(tǒng)計(jì)量F。若F小于自由度為(f1，f2)及給定顯著性水平α(選取α=0.05)的臨界值F(f1，f2)，則表明樣品內(nèi)和樣品間無顯著性差異，樣品是均勻的。

2.2 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

將分裝樣品放于-18℃冷凍保存，按照先密后疏的間隔原則在180天內(nèi)進(jìn)行測定，分別在第10、20、60、90、180天隨機(jī)取樣，平行2份測定，根據(jù)測定結(jié)果進(jìn)行冷凍條件下樣品的穩(wěn)定性檢驗(yàn)。

由于沒有合適的物理/化學(xué)模型來真實(shí)地描述該標(biāo)準(zhǔn)樣品中除草劑的降解機(jī)理，故采用直線作為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚7]。若該條件下白菜汁中除草劑含量穩(wěn)定，則希望該模型中的截距等于測定值，而斜率趨近于零。

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測方法的適用性驗(yàn)證

選用合適的測定方法是標(biāo)準(zhǔn)樣品研制和定值的基礎(chǔ)，實(shí)驗(yàn)采用的方法參考文獻(xiàn)[5，6]，并同時(shí)通過實(shí)驗(yàn)方法的回收率和重復(fù)性來驗(yàn)證測定方法的可靠性，回收率數(shù)據(jù)可用于制樣過程引入的不確定度分量的計(jì)算。用未添加除草劑的白菜汁作空白，添加水平為200 μg/kg，重復(fù)6次進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表1。該方法滿足農(nóng)藥殘留檢測要求。

表1 添加回收試驗(yàn)結(jié)果 %

3.2 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

均勻性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)見表2。由表3中公式進(jìn)行計(jì)算，f1=9，f2=10，樣品內(nèi)和樣品間的平方和、均方及F值見表4。由表4結(jié)果可看出F值均小于臨界值F0.05(9，10)=3.02，即樣品的均勻性良好[7]。

表2 均勻性檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) μg/kg

表3 均勻性檢驗(yàn)公式[7]

表4 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

3.3 穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

5個(gè)時(shí)間點(diǎn)測得的除草劑含量的平均值見表5。

表5 穩(wěn)定性檢驗(yàn)數(shù)據(jù) μg/kg

直線模型[8]可表示為：

Y=b0+b1X+ε

式中：b0、b1——回歸系數(shù)；

ε——隨機(jī)誤差分量。

直線中點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

與斜率相關(guān)的不確定度：

查表得，自由度為n-2=4，P=0.95時(shí)，t因子等于2.8，比較︱b1︱與t0.95,n-2·s(b1)的大小，若前者小說明斜率不顯著，計(jì)算結(jié)果見表6。由表6可知，3種除草劑的︱b1︱值均小于t0.95,n-2·s(b1)，表明4種除草劑在 -18℃冷凍條件下180天內(nèi)無明顯的降解趨勢，未觀測到不穩(wěn)定性。

表6 穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

3.4 標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值及不確定度評定

根據(jù)文獻(xiàn)[9，10]，標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值方法如下：將均勻性測定結(jié)果中除草劑的平均濃度作為該標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度，并且對研制過程中引入的不確定度進(jìn)行評定。標(biāo)準(zhǔn)樣品研制過程中的不確定度包括實(shí)驗(yàn)方法引入的不確定度、樣品均勻性引入的不確定度及樣品穩(wěn)定性引入的不確定度。由于實(shí)驗(yàn)已驗(yàn)證樣品的均勻性和穩(wěn)定性均良好，故這兩部分引入的不確定度可忽略，僅考慮實(shí)驗(yàn)方法帶來的不確定度，以乙草胺為例不確定度分量及來源列于表7。

合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度按下式計(jì)算：

uc=wuc,rel=130×0.095 97=12.48 (μg/kg)

取包含因子k=2，則擴(kuò)展不確定度為：

U=kuc=2×12.48=25.0 (μg/kg)

3種除草劑的定值結(jié)果及不確定度列于表8。

表7 標(biāo)準(zhǔn)樣品定值結(jié)果的不確定度分量及來源

表8 標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值結(jié)果及不確定度 μg/kg

[1] 張為農(nóng)．近期我國除草劑和殺菌劑市場概況[J]．中國農(nóng)藥，2009(7)：52-53.

[2] 鄭和輝，葉常明．甲草胺和丁草胺等除草劑在多個(gè)介質(zhì)環(huán)境中環(huán)境行為綜述[J]．環(huán)境科學(xué)進(jìn)展，1999,7(3)：1-10.

[3] 姚斌，徐建民，張超蘭．除草劑丁草胺的環(huán)境行為綜述[J]．生態(tài)環(huán)境， 2003，12(1)：66-70.

[4] Yakovleva J, Zherdev A V, Popova V A, et al. Production of antibodies and development of enzyme-linked immunosorbent assays for herbicide butachlor[J].Anal Chem Acta, 2003,491:1-13.

[5] 王建華，王艷麗，牟俊，等.兩種離子源技術(shù)GC/MS法檢測蔬菜中多類除草劑的殘留量 [J]．分析實(shí)驗(yàn)室，2009(3)：1-5.

[6] 王建華,郭翠,趙亮,等. 氣相色譜-負(fù)化學(xué)電離質(zhì)譜測定蔬菜中啶蟲丙醚的殘留量[J].化學(xué)分析計(jì)量，2009(5)：45-47.

[7] CNAS-GL03 能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價(jià)指南[S].

[8] CNAS-GL04 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)者能力認(rèn)可準(zhǔn)則[S].

[9] 昃向君，陳世山，劉心同，等．食品安全檢測實(shí)驗(yàn)室測量不確定度的評定與應(yīng)用[M]．青島：中國海洋大學(xué)出版社，2007.

[10] GB/T 15000.3-2008/ISO Guide 35 標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則(3)標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法[S]．