(1.山東省科學(xué)院生物研究所，濟(jì)南 250014； 2. 山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250010；3.山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250014； 4.山東魯洲生物科技有限公司，沂水 276400)

目前食品中還原糖的分析方法較多，現(xiàn)行國(guó)家專(zhuān)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[1]及國(guó)際官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)推薦方法[2]中，均采用容量分析法，即斐林試劑滴定法和高錳酸鉀滴定法。這兩種方法對(duì)滴定終點(diǎn)的判斷帶有經(jīng)驗(yàn)性，干擾因素多[3]，受操作者主觀因素影響較大，對(duì)還原糖的評(píng)價(jià)不夠準(zhǔn)確。除經(jīng)典的滴定分析方法外，儀器分析方法有液相色譜法[4]、電化學(xué)法[5-8]、間接原子吸收法[9]和分光光度法[10,11]等。斐林試劑光度法[12]由于斐林試液與還原糖作用后產(chǎn)生氧化亞銅沉淀，測(cè)定溶液吸光度時(shí)需進(jìn)行離心分離，比較繁瑣；鐵氰化鉀光度法[13]則要求在沸水浴條件下反應(yīng)，且時(shí)間較長(zhǎng)。許漢英等[14]建立了蜂蜜中還原糖的流動(dòng)注射-分光光度分析方法。筆者利用還原糖與鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]反應(yīng)后生成的亞鐵氰化鉀[K4Fe(CN)6]能夠進(jìn)行電化學(xué)測(cè)定的原理，將流動(dòng)注射技術(shù)與電化學(xué)安培方法相結(jié)合，研究還原糖的流動(dòng)電化學(xué)檢測(cè)裝置和方法，旨在為食品中還原糖測(cè)定及產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)提供快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

電化學(xué)分析儀：CHI614c型，上海辰華儀器公司；

恒溫水浴鍋：HH-S型，江蘇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；

電化學(xué)三電極檢測(cè)系統(tǒng)：自制Ag/AgCl參比電極(1 mol/L KCl)，直徑2 mm金圓盤(pán)工作電極(天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司)，自制不銹鋼管輔助電極；

葡萄糖、鐵氰化鉀、氫氧化鈉：均為分析純；

蜂蜜：市售；

實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖儲(chǔ)備液：200.0 g/L，精確稱取20.00 g烘干葡萄糖，加蒸餾水溶解，定容至100 mL，備用。

系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確移取75.0、50.0、25.0、12.5 mL 200.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖儲(chǔ)備液，用蒸餾水定容至100 mL，配制成濃度分別為150.0、100.0、50.0、25.0 g/L的系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

0.5% K3Fe(CN)6-1.2%NaOH混合溶液：準(zhǔn)確稱取2.500 g K3Fe(CN)6和6.000 g NaOH，用蒸餾水溶解后，定容至500 mL，備用。此混合溶液可在室溫下放置1個(gè)月。

蜂蜜待測(cè)液：稱取混合均勻的蜂蜜樣品約6 g(精確到0.001 g)，用蒸餾水溶解，然后移入50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。

橙汁：某品牌橙汁飲料原液作為待測(cè)液。

發(fā)酵液：將2份發(fā)酵液離心后取上清液作為待測(cè)液。

糖化液：將5份糖化液離心后取上清液，分別稀釋3、5、5、5、7倍，配制成待測(cè)液。

1.3 試驗(yàn)方法

(1)裝置和原理

實(shí)驗(yàn)裝置示意圖見(jiàn)圖1。在儲(chǔ)液瓶中裝有0.5% K3Fe(CN)6-1.2% NaOH的底液，通過(guò)蠕動(dòng)泵進(jìn)樣到預(yù)混池，預(yù)混池上端有一直徑2 mm的小孔。當(dāng)測(cè)樣時(shí)用微量注射器取10 μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液或含有還原糖的待測(cè)溶液，通過(guò)預(yù)混池上端小孔注入。電磁攪拌池中溶液使待測(cè)液與底液充分混合后，通過(guò)蠕動(dòng)泵將混合液泵入水浴加熱的盤(pán)管反應(yīng)器中，還原糖在堿性溶液中能將K3Fe(CN)6還原為K4Fe(CN)6；反應(yīng)溶液進(jìn)一步流經(jīng)在室溫水浴中的盤(pán)管使溶液冷卻。最后包含K4Fe(CN)6、NaOH、過(guò)量的K3Fe(CN)6等物質(zhì)的溶液進(jìn)入測(cè)定池。在反應(yīng)中由于K3Fe(CN)6是過(guò)量的，還原糖含量與生成的K4Fe(CN)6的濃度呈一定摩爾關(guān)系，而K4Fe(CN)6是一種電化學(xué)氧化還原活性物質(zhì)，在一定正電位下能夠被氧化生成K3Fe(CN)6。測(cè)定池為自行設(shè)計(jì)的適合流動(dòng)檢測(cè)的電化學(xué)檢測(cè)池，兩邊分別固定Ag/AgCl參比電極和金圓盤(pán)工作電極，其中一段用作溶液流通管道的不銹鋼管作為輔助電極，通過(guò)CHI614c電化學(xué)工作站在工作電極上施加恒定電位，記錄由K4Fe(CN)6氧化產(chǎn)生的氧化電流，由計(jì)算機(jī)輸出圖形。由于K4Fe(CN)6的氧化電流與還原糖濃度呈一定的相關(guān)性，因此可以根據(jù)測(cè)得的K4Fe(CN)6氧化電流信號(hào)計(jì)算還原糖的含量。

1—儲(chǔ)液瓶； 2—蠕動(dòng)泵； 3—預(yù)混池； 4—熱水?。?5—冷水??； 6—參比電極； 7—工作電極； 8—輔助電極； 9—測(cè)定池； 10—廢液； 11—數(shù)據(jù)輸出圖1 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖

(2)參比電極的制作

將一根直徑500 μm、長(zhǎng)約5 cm的Ag絲用金相砂紙打磨掉表面的氧化層，直至明亮光滑，以保證鍍?cè)贏g絲上的AgCl層均勻牢固，從而達(dá)到其電位穩(wěn)定。將打磨好的Ag絲在丙酮中超聲清洗約30 min，除去Ag絲表面油污、雜質(zhì)等，再在二次水中超聲清洗3次，每次5 min。以清洗干凈的Ag絲作為正極，另一根直徑為500 μm Ag絲作為負(fù)極，兩電極間加+1.5 V直流電壓，在1.00×10-3mol/L KCl溶液中進(jìn)行電鍍。在作為正極的Ag絲表面會(huì)有AgCl生成，約12 h后，取出鍍好的Ag/AgCl絲。在未鍍有AgCl的Ag絲一端焊上一根粗銅絲，起導(dǎo)電作用，并且避免實(shí)驗(yàn)過(guò)程中Ag絲被折斷。把Ag/AgCl絲插入一根加工好的前端封有素?zé)沾傻木鬯姆蚁┕苤校广~絲與Ag絲接界處的焊錫剛好處于管口外，向管中注入1 mol/L KCl溶液，然后用環(huán)氧樹(shù)脂膠封閉管口，室溫固化24 h。最后將做好的Ag/AgCl參比電極插入一個(gè)盛滿1 mol/L KCl溶液的塑料瓶中，保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)定電位的選擇

取50.0 g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL注入預(yù)混池中，使用電化學(xué)分析儀的循環(huán)伏安技術(shù)記錄工作電極在0～0.45 V間的循環(huán)伏安曲線，如圖2所示。由于K3Fe(CN)6和K4Fe(CN)6是一對(duì)可逆的氧化還原物質(zhì)，所以此圖為溶液中過(guò)量的K3Fe(CN)6與反應(yīng)生成的K4Fe(CN)6共同在金圓盤(pán)工作電極上反應(yīng)產(chǎn)生的循環(huán)伏安圖。從圖2中可看出K4Fe(CN)6從0.1 V開(kāi)始被氧化為K3Fe(CN)6，電位為0.26 V時(shí)氧化電流達(dá)到峰值。當(dāng)用安培法測(cè)定K4Fe(CN)6的氧化電流時(shí)，工作電極的檢測(cè)電位必須設(shè)定為比0.26 V更高的電位，本實(shí)驗(yàn)選擇電位為0.40 V。

圖2 工作電極在K4Fe(CN)6溶液中的循環(huán)伏安曲線

2.2 進(jìn)液管道直徑與測(cè)定池直徑比例的選擇

由于工作電極產(chǎn)生的檢測(cè)電流在微安級(jí)，所以當(dāng)進(jìn)液管道的直徑與測(cè)定池的直徑之比為1∶4時(shí)，進(jìn)液泵蠕動(dòng)產(chǎn)生的脈動(dòng)波將對(duì)檢測(cè)電流產(chǎn)生脈動(dòng)波形干擾，如圖3中曲線1所示；而當(dāng)二者之比為1∶4.5時(shí)進(jìn)液泵產(chǎn)生的脈動(dòng)波形干擾減輕，見(jiàn)圖3中曲線2；當(dāng)二者比值為1∶5時(shí)，脈動(dòng)干擾進(jìn)一步減輕，見(jiàn)圖3中曲線3。在本實(shí)驗(yàn)裝置實(shí)際使用過(guò)程中控制進(jìn)液管道直徑與測(cè)定池直徑之比為1∶6可以完全消除蠕動(dòng)泵產(chǎn)生的脈動(dòng)波干擾，見(jiàn)圖3中曲線4。

曲線1～4進(jìn)液管道的直徑與測(cè)定池的直徑之比依次為1∶4、1∶4.5、1∶5、1∶6圖3 脈動(dòng)波對(duì)測(cè)定電流的影響

2.3 測(cè)定液流動(dòng)狀態(tài)的選擇

在多數(shù)電化學(xué)測(cè)定過(guò)程中，需要保證溶液本體濃度不隨反應(yīng)的進(jìn)行而改變。在本實(shí)驗(yàn)中，若使溶液在靜止?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行電化學(xué)測(cè)定，由于研究電極面積與溶液體積之比較大，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，電極附近溶液中K4Fe(CN)6的本體濃度逐漸降低，從而使得反應(yīng)電極上的測(cè)定電流在電極去極化穩(wěn)定后很快就出現(xiàn)衰減現(xiàn)象，導(dǎo)致數(shù)據(jù)讀取困難、采樣終點(diǎn)波動(dòng)、分析誤差增大。為了保證電極表面K4Fe(CN)6的濃度保持穩(wěn)定，將待測(cè)液在電磁攪拌下測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攪拌引起的噪音很大，完全掩蓋了測(cè)定電流信號(hào)。當(dāng)溶液在流動(dòng)狀態(tài)下進(jìn)行測(cè)定時(shí)，發(fā)現(xiàn)測(cè)定電流曲線在30～60 s內(nèi)平直穩(wěn)定無(wú)衰減，且3次測(cè)定的電流曲線基本重合。所以本實(shí)驗(yàn)中選擇溶液在流動(dòng)狀態(tài)下進(jìn)行電化學(xué)測(cè)定。

2.4 反應(yīng)液中氣泡對(duì)測(cè)定的影響及其消除

還原糖與鐵氰化鉀的反應(yīng)需在60～100℃進(jìn)行[12]，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)加熱時(shí)反應(yīng)液中會(huì)產(chǎn)生氣泡，反應(yīng)溫度越高，測(cè)定液中氣泡越多，夾雜著氣泡的溶液流經(jīng)測(cè)定池中的電極表面，對(duì)測(cè)定電流干擾也越大。當(dāng)反應(yīng)溫度為100℃時(shí)，大量氣泡的產(chǎn)生對(duì)測(cè)定電流產(chǎn)生很大干擾；當(dāng)溫度為95℃時(shí)，由氣泡產(chǎn)生的噪音干擾仍較大。隨著溫度的降低，干擾越來(lái)越小。當(dāng)溫度為90℃時(shí)，由氣泡產(chǎn)生的噪音干擾明顯減少；當(dāng)溫度降為85℃時(shí)，管道中只有極少的氣泡引起電流波動(dòng)。經(jīng)觀察進(jìn)液管道中的氣泡進(jìn)入測(cè)定池后都是貼著池壁上行，上行中的氣泡一旦經(jīng)過(guò)電極表面即對(duì)測(cè)定電流產(chǎn)生干擾，而要使氣泡上行時(shí)不接觸電極表面，必須使進(jìn)液管道直徑小于測(cè)定池直徑的5倍以上。本實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)溫度為85℃，使用自行設(shè)計(jì)的合適尺寸的測(cè)定池，即可消除氣泡對(duì)測(cè)定的干擾，得到平滑穩(wěn)定的電流曲線。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及檢出限

在預(yù)混池中泵入包含0.5% K3Fe(CN)6和1.2% NaOH的混合液后，用微量注射器分別取0、25.0、50.0、100.0、150.0 g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL注入預(yù)混池中進(jìn)行測(cè)定。每更換一次葡萄糖溶液，第1次進(jìn)入測(cè)定池的溶液用作清洗管道和測(cè)定池，不進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，從第2次進(jìn)入的溶液開(kāi)始電化學(xué)安培法檢測(cè)。測(cè)定池中的溶液在流動(dòng)狀態(tài)下恒定工作電極電位0.40 V(vs.Ag/AgCl)，記錄K4Fe(CN)6被氧化的電流-時(shí)間(i-t)曲線。取30 s時(shí)的穩(wěn)定電流i，繪制電流-葡萄糖濃度(i-c)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性回歸方程為i=1.821+0.058 1c。i為K4Fe(CN)6的穩(wěn)定氧化電流(A)，c為標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度(g/L)，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9?？梢?jiàn)此體系還原糖濃度在0～150.0 g/L范圍內(nèi)，與K4Fe(CN)6的氧化電流之間有良好的線性關(guān)系。

移取50.0 g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL注入預(yù)混池中，連續(xù)測(cè)定8次，由K4Fe(CN)6氧化電流(見(jiàn)表1)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍與工作曲線斜率之比，得檢出限為1.19 g/L。

2.6 精密度試驗(yàn)

分別準(zhǔn)確移取50.0 g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和橙汁待測(cè)液10 μL注入預(yù)混池，重復(fù)測(cè)定8次，由所測(cè)的K4Fe(CN)6氧化電流計(jì)算出對(duì)應(yīng)的葡萄糖濃度和樣品中的還原糖含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=8)

由表1可見(jiàn)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.74%、1.72%，證明此方法的精密度良好。

2.7 樣品的測(cè)定及加標(biāo)回收試驗(yàn)

取10 μL樣品待測(cè)液注入預(yù)混池中，以下同標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制。每份樣品平行測(cè)定3次，將i-t曲線上30 s時(shí)的穩(wěn)定電流i取平均值，數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，從而計(jì)算出待測(cè)樣液中還原糖的含量(以葡萄糖計(jì))。

在被測(cè)樣品中加入已知含量的葡萄糖溶液，進(jìn)行不同樣品的回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

表2結(jié)果表明，該檢測(cè)方法測(cè)定不同類(lèi)型樣品的回收率為97.8%～101.2%，說(shuō)明該方法抗干擾性能良好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能滿足測(cè)定不同類(lèi)型樣品的需要。

2.8 對(duì)照試驗(yàn)

對(duì)配制的糖化液和發(fā)酵液待測(cè)液進(jìn)行電化學(xué)測(cè)定，同時(shí)用常規(guī)斐林滴定法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 對(duì)照試驗(yàn)(n=3)

對(duì)兩組結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，P>0.05，表明兩種分析方法無(wú)顯著差異。

3 結(jié)論

將流動(dòng)注射技術(shù)與電化學(xué)檢測(cè)相結(jié)合，設(shè)計(jì)了適合流動(dòng)注射測(cè)定的電化學(xué)檢測(cè)池，并使溶液混合、反應(yīng)、檢測(cè)集中于一條管道中，實(shí)現(xiàn)了橙汁、蜂蜜、糖化液、發(fā)酵液多種樣品中還原糖的半自動(dòng)電化學(xué)檢測(cè)。該法具有準(zhǔn)確度高、精密度好、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，可以滿足多種樣品中還原糖測(cè)定的需要。

方法的線性范圍寬，還原糖濃度在0～150.0 g/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系；對(duì)于還原糖含量高的樣品，可以減小待測(cè)樣的稀釋倍數(shù)，降低了因稀釋倍數(shù)太大導(dǎo)致的誤差。提高了還原糖的分析速度，電極實(shí)際響應(yīng)時(shí)間約30 s，加上前處理樣品的測(cè)定時(shí)間不超過(guò)4 min，尤其適用于大量樣品的分析。與光度法相比，電化學(xué)技術(shù)不受溶液顏色、濁度的影響，抗干擾力較強(qiáng)。

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