王廣生 王 菲 強(qiáng) 輝 強(qiáng) 杰 陜西省寶雞市華山醫(yī)院骨科(寶雞 721000）

白藜蘆醇抗氧化應(yīng)激效應(yīng)對大鼠脊髓損傷組織的保護(hù)

王廣生 王 菲△強(qiáng) 輝▲強(qiáng) 杰 陜西省寶雞市華山醫(yī)院骨科(寶雞 721000）

目的:探討白藜蘆醇對大鼠急性脊髓損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制。方法:48只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和白藜蘆醇干預(yù)組 ,每組 16只。術(shù)后 6h、12h評定各組大鼠神經(jīng)功能,檢測脊髓組織 MDA、SOD的含量,ELISA法檢測各組大鼠血清 TNF-α及 IL-6表達(dá)。結(jié)果:術(shù)后 6h、12h白藜蘆醇治療組神經(jīng)功能較模型組顯著提高。模型組脊髓組織 MDA含量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05）,SOD顯著低于假手術(shù)組(P＜0.05）;術(shù)后 6h、12h模型組 TNF-α及 IL-6水平顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05）。白藜蘆醇組 MDA含量顯著低于模型組(P＜0.05）,SOD水平顯著高于模型組(P＜0.05）;白藜蘆醇治療組 TNF-α及IL-6水平顯著降低于模型組 (P＜0.05）。結(jié)論:白藜蘆醇可能通過降低急性脊髓損傷后的氧化應(yīng)激水平,減輕脊髓炎癥程度而發(fā)揮對其保護(hù)作用。

脊髓損傷是涉及多因素、累及多個環(huán)節(jié),導(dǎo)致脊髓組織細(xì)胞損傷、脊髓間質(zhì)水腫和出血的一種急性創(chuàng)傷性疾病。氧化應(yīng)激是在機(jī)體內(nèi)活性氧生成和抗氧化物質(zhì)失衡狀態(tài)下,直接或間接通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起細(xì)胞的損傷,是許多疾病的病因,通過抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生可以有效的抑制疾病的發(fā)生發(fā)展[1～3]。近年來研究表明,氧化應(yīng)激機(jī)制在脊髓損傷的發(fā)病中發(fā)揮重要作用,與脊髓炎時脊髓及脊髓外器官的損傷有密切的聯(lián)系[4,5]。白藜蘆醇是白藜蘆醇塊根的主要有效成分,含量較其他組分高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、容易獲得。研究表明,RES具有較強(qiáng)的抗氧化作用,成為正在開發(fā)的新一代抗氧化應(yīng)激植物藥[6～8]。本研究利用大鼠脊髓損傷模型,觀察 RES對脊髓組織氧化應(yīng)激的抑制作用,為 RES的臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動物與材料 取體重 280～320g清潔級健康雄性 SD大鼠 48只,由西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供并代為飼養(yǎng)。所有動物實(shí)驗(yàn)遵循我國動物研究委員會的條款并依照美國關(guān)愛和使用動物健康研究院的準(zhǔn)則進(jìn)行(NationalInstitutesofHealthpublicationNO.96-23,revised1996）。丙二醛 (MDA）、超氧化物歧化酶 (SOD）試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。血清 TNF-α及 IL-6 ELISA法檢測試劑盒由晶美生物工程有限公司提供。

1.2 方法 1.2.1實(shí)驗(yàn)動物分組及脊髓損傷模型制備:48只 SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、脊髓損傷模型組、白藜蘆醇治療組,每組 16只。假手術(shù)組,僅行手術(shù)暴露,不給予打擊及治療;脊髓打擊傷組,脊髓打擊損傷后給予等量生理鹽水作為對照;白藜蘆醇治療組于術(shù)后即刻腹腔注射 RES(200mg/kg）。脊髓損傷模型制備如下所述:大鼠禁食 12h,禁水 4h,戊巴比妥鈉(1.2mg/kg）腹腔注射麻醉。腹腔麻醉后,俯臥位固定,胸背部剃毛備皮 ,碘伏消毒皮膚,鋪一次性無菌單。以 T8棘突中心作長約 3cm切口暴露硬脊膜 ,用自制改良的 Allen裝置制備脊髓急性打擊傷動物模型,損傷力度為 25gcm(10g× 2.5cm）。造成大鼠脊髓不完全損傷,致傷后迅速移開打擊物,0號線逐層縫合。模型成功的判定標(biāo)準(zhǔn):打擊后 ,損傷處脊髓出血、水腫,大鼠出現(xiàn)擺尾反射,雙下肢及軀體回縮樣撲動,麻醉清醒后雙下肢呈弛緩性癱瘓。術(shù)后即刻給予青霉素注射液 5萬 u背外側(cè)肌群肌注預(yù)防感染 ,每天 1次 ,持續(xù) 3d。注意保溫,分籠飼養(yǎng),自由取食。每天更換一次墊料保持干燥,每日膀胱按摩兩次致自主排尿反射建立。組中動物如死亡,隨時補(bǔ)充。

1.2.2 神經(jīng)功能評估:采用 BBB(theBassoBeattie Bresnahanlocomotorratingscale,BBB）分級法,各組動物在術(shù)后 6h,12h評估后肢運(yùn)動功能。評分標(biāo)準(zhǔn):第一部(0-7分 ）評判動物后肢各關(guān)節(jié)活動;第二部(8-13分 ）評判動物后肢的步態(tài)和協(xié)調(diào)功能;第三部(14-21分）評估動物運(yùn)動時爪子的精細(xì)運(yùn)動,三項(xiàng)滿分 21分。采用雙盲法,每次評分由經(jīng)培訓(xùn)后的兩個非本實(shí)驗(yàn)人員分別獨(dú)立完成,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.2.3 脊髓組織 MDA、SOD檢測:術(shù)后 6h,12h,大鼠戊巴比妥鈉麻醉后取脊髓組織,稱重后加入相應(yīng)比例的生理鹽水,用低溫勻漿機(jī)制成 100g/L的組織勻漿,在-10℃,3500r/min離心 20min,于-20℃保存待測。根據(jù) MDA、SOD測定試劑盒中說明書的步驟進(jìn)行 SOD、MDA測定。

1.2.4 血 TNF-α及 IL-6檢測:術(shù)后 6h,12h,大鼠戊巴比妥鈉麻醉后將各組實(shí)驗(yàn)大鼠開胸,迅速從心臟抽血 2mL,靜置30min后 ,4℃ ,3000r/min離心 10min(離心半徑 8cm）,取上清,血 TNF-α及 IL-6應(yīng)用晶美生物工程有限公司提供的ELISA檢測試劑盒檢測,詳細(xì)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示,組間比較采用方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè) α=0.05。

2 結(jié) 果2.1 神經(jīng)功能評估 BBB評分結(jié)果如表 1顯示 SCI后假手術(shù)組評分變化近似于正常值,無明顯改變。在同一時相點(diǎn),其他兩組較假手術(shù)組呈顯著性差異(P＜0.05）。白藜蘆醇治療組與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05）。

表1 脊髓損傷后 6h、12hBBB神經(jīng)功能評分

2.2 術(shù)后各組大鼠脊髓組織 MDA和 SOD的水平 術(shù)后 6h、12h模型組脊髓組織中 MDA含量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05）,SOD水平顯著低于假手術(shù)組(P＜0.05）;白藜蘆醇組MDA含量顯著低于模型組(P＜0.05）,SOD水平顯著高于模型組 (P ＜ 0.05）。 (見表 1）。

表1 各組大鼠脊髓組織 MDA、SOD含量的比較(±s）

表1 各組大鼠脊髓組織 MDA、SOD含量的比較(±s）

注:同時間點(diǎn)與假手術(shù)組比較 ,△P＜0.05;同時間點(diǎn)與模型組比較,▲P＜0.05

組 別 時間點(diǎn)(h）MDA(nmol/mg）SOD(U/mg）假手術(shù)組 6 12 5.9±0.4 5.9±1.2 151.2± 9.6△143.7± 7.4△白藜蘆醇治療組 6 12 523.1±12.3 533.6±10.9模型組 6 12 32.4± 1.6△36.5± 2.1△22.1± 0.8△▲25.3± 1.0△▲276.4± 18.6△▲288.3± 15.3△▲

2.3 術(shù)后各組大鼠血清 TNF-α及 IL-6水平 術(shù)后 6h、12h模型組血清 TNF-α及 IL-6水平均顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05）;白藜蘆醇組血清 TNF-α及 IL-6水平顯著降低于模型組(P＜0.05）,但白藜蘆醇組血清淀粉酶水平仍顯著高于假手術(shù)組(P ＜0.05）(見表 2）。

表2 各組大鼠血清 TNF-α及 IL-6水平比較 (±s）

表2 各組大鼠血清 TNF-α及 IL-6水平比較 (±s）

注:同時間點(diǎn)與假手術(shù)組比較,△P＜0.05;同時間點(diǎn)與模型組比較,▲P＜0.05

組 別 時間點(diǎn)(h）TNF-α(ng/L）IL-6(ng/L）假手術(shù)組 6 12 10.32±0.87 10.68±0.42 49.68± 1.25△55.68± 0.89△白藜蘆醇治療組 6 12 8.11±0.46 8.34±0.14模型組 6 12 69.04± 0.61△79.68± 0.56△36.23± 0.97△▲30.57± 0.65△▲35.36± 0.77△▲32.29± 4.22△▲

3 討 論脊髓損傷的機(jī)制尚未完全闡明,目前研究表明,氧化應(yīng)激在其發(fā)生中發(fā)揮重要作用。目前認(rèn)為,氧自由基(oxygenfreeradical,OFR）在脊髓損傷發(fā)病過程中大量產(chǎn)生,OFR對機(jī)體的損害可能起著一種扳機(jī)樣作用,鈣超負(fù)荷是細(xì)胞損害的一條最終的共同途徑[9]。SOD是催化超氧陰離子歧化反應(yīng)的酶類,細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化酶和自由基清除劑,能保護(hù)細(xì)胞、對抗氧自由基的侵害[10],其水平的高低,表明其保護(hù)組織細(xì)胞免受毒性氧自由基損傷的效能強(qiáng)弱。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物,測定 MDA可直接反映自由基水平,其含量高低是組織細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志[11]。通過 MDA含量和 SOD活性的測定可以間接反映體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的能力。通過我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),術(shù)后 6h、12h模型組脊髓組織中 MDA含量顯著高于假手術(shù)組,SOD水平顯著低于假手術(shù)組,說明氧化應(yīng)激機(jī)制參與了脊髓損傷的發(fā)病過程。當(dāng)應(yīng)用白藜蘆醇后,MDA含量則顯著低于模型組,SOD水平顯著高于模型組,神經(jīng)功能評分明顯提高,表明白藜蘆醇能夠有效抑制氧化應(yīng)激而發(fā)揮其對脊髓損傷的保護(hù)作用。

脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)是引起脊髓繼發(fā)性損傷的重要因素。 腫瘤壞死因子 (TNF-α）、白細(xì)胞介素 -1β (IL-1β）、白細(xì)胞介素-10(IL-10）、髓過氧化物酶 (MPO）等炎癥因子可刺激其他細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,這些細(xì)胞因子還可作為內(nèi)皮細(xì)胞活化的信號,刺激細(xì)胞粘附分子的產(chǎn)生及白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附,誘導(dǎo)白細(xì)胞向損傷區(qū)浸潤。白細(xì)胞浸潤破壞血腦屏障,進(jìn)一步加重脊髓損傷后脊髓損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,術(shù)后 6h、12h模型組血清 TNF-α及 IL-6水平均顯著高于假手術(shù)組;提示中性粒細(xì)胞浸潤及細(xì)胞因子的表達(dá)上調(diào)參與了脊髓損傷發(fā)生發(fā)展過程。而應(yīng)用白藜蘆醇后大鼠血清 TNF-α及 IL-6水平顯著降低于模型組,表明白藜蘆醇能夠通過降低大鼠脊髓損傷后脊髓組織中TNF-α及 IL-6水平,減輕脊髓組織中性粒細(xì)胞浸潤及細(xì)胞因子表達(dá),減輕損傷后脊髓組織內(nèi)過度的炎癥級聯(lián)反應(yīng),發(fā)揮其保護(hù)作用。

我們的研究表明,利用白藜蘆醇治療脊髓損傷后大鼠運(yùn)動神經(jīng)元的功能得到較好恢復(fù)。研究結(jié)果證實(shí)白藜蘆醇對大鼠急性脊髓損傷具有保護(hù)作用,其部分機(jī)制可能與白藜蘆醇能夠降低脊髓組織氧化應(yīng)激水平、提高抗氧化酶活力、恢復(fù)脊髓組織內(nèi)氧化與抗氧化動態(tài)平衡、減少中性粒細(xì)胞浸潤及促炎細(xì)胞因子合成有關(guān)。

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脊髓損傷 /中醫(yī)藥療法 白藜蘆醇 /分析 大鼠 實(shí)驗(yàn)研究

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A

1000-7369(2011）01-0111-03

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(收稿 2010-08-09;修回 2010-09-12）