王 菲 王廣生 強 輝 強 杰 陜西省第七建筑工程公司職工醫(yī)院(寶雞 721000）

川芎嗪對皮質(zhì)神經(jīng)元在氧糖剝奪損傷中的保護作用

王 菲 王廣生△強 輝▲強 杰△陜西省第七建筑工程公司職工醫(yī)院(寶雞 721000）

目的:探討川芎嗪對培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元在氧糖剝奪損傷中的保護作用及可能機制。方法:原代培養(yǎng)新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元,利用氧糖剝奪建立皮質(zhì)神經(jīng)元缺血再灌損傷模型。應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽(MTT）測定細胞活力。應(yīng)用乳酸脫氫酶(LDH）、超氧化物歧化酶(SOD）活性及丙二醛(MDA）試劑盒分別檢測 LDH、SOD活性及 MDA含量。應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結(jié)果:氧糖剝奪損傷后細胞存活率降低,LDH釋放上升,SOD活性下降,MDA含量明顯增加,細胞凋亡率顯著升高(P＜0.05）。川芎嗪可濃度依賴性地提高細胞的存活率和 SOD水平,減少 LDH釋放和 MDA含量,抑制細胞凋亡(P＜0.05）。結(jié)論:川芎嗪對培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元在氧糖剝奪損傷中有保護作用,其保護機制可能與葛根素穩(wěn)定細胞膜,減輕氧化損傷,及抑制細胞凋亡有關(guān)。

缺血再灌注損傷的發(fā)生與氧自由基釋放、線粒體損傷、鈣離子超載、炎癥細胞的介入及參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號分子的激活等因素有關(guān)[1～3]。缺血再灌注損傷的共性為各種器官、組織、細胞遭受了病程久暫、輕重不同的缺氧及其后更為嚴重的復(fù)氧損傷。川芎嗪(Tetramethyl pyrazine,TMP）是從川芎等植物中分離出的一種生物堿單體,化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪。研究發(fā)現(xiàn),川芎嗪對中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血 /再灌注損傷有明顯保護作用,但缺少離體細胞學(xué)的實驗證據(jù),且保護作用機制尚不清楚。本實驗采用體外培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元為研究對象,以氧糖剝奪方法建立缺氧缺糖 /復(fù)氧復(fù)糖損傷的離體模型,觀察川芎嗪的神經(jīng)保護作用并初步探討其作用機制。

1 材料與方法1.1 試劑和儀器 MTT,DMSO購自美國 Sigma公司;LDH檢測試劑盒,SOD檢測試劑盒及 MDA檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所 ;AnnexinV/FITC試劑盒購自上海晶美生物工程公司;川芎嗪(批號:H62021030）甘肅蘭藥藥業(yè)集團公司。二氧化碳培養(yǎng)箱(美國 SHELLAB公司）;倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司）;全自動酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK公司 ）;熒光分光光度計 (日本 Shimadzu公司）流式細胞儀(美國 Becton-Dickinson公司）。

1.2 大腦皮層神經(jīng)細胞的培養(yǎng) 1～ 3天 SD大鼠,由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供,并征得西安交通大學(xué)動物倫理委員會同意。無菌條件下分離 1-3天 SD大鼠的大腦皮層置于含 2.5g/L胰蛋白酶的 D-Hank’s液中,37℃消化 15分,加入含100ml/L牛血清的 DMEM/F12培養(yǎng)液中止胰酶的作用,移液管輕輕吹打為單細胞懸液,調(diào)整細胞密度為 (1～ 2）× 105個 /ml,接種于預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸覆蓋的 96孔板中。接種的第 5～7天加人阿糖胞苷 (終濃度為 0.01mmol/L）處理 24小時以抑制膠質(zhì)細胞的增殖。當(dāng)接種細胞融合達 80%后,常規(guī)消化后傳代培養(yǎng)。取第 3代細胞進行鑒定及相關(guān)實驗。

1.3 體外缺氧缺糖 /復(fù)氧復(fù)糖(OGD-R）模型的建立 取生長期大腦皮層神經(jīng)細胞,將培養(yǎng)液換成無糖 DMEM培養(yǎng)液,用 95%N2～～5%CO2混合氣驅(qū)趕培養(yǎng)液和培養(yǎng)板中的空氣,嚴密封口后 ,置于 37℃含 95%N2～ 5%CO2的密閉培養(yǎng)箱中,模擬缺血 ,4h后取出培養(yǎng)板,更換常規(guī) DMEM培養(yǎng)液,并恢復(fù)正常培養(yǎng)環(huán)境,繼續(xù)培養(yǎng) 24h,模擬再灌注,建立細胞 OGD-R模型更換正常培養(yǎng)液時,TMP組同時加入相應(yīng)濃度的 TMP。

1.4 細胞分組和處理 實驗隨機分為三組:對照組,OGD-R模型組,TMP組 (終濃度分別為 0.05μmol/L,0.1μmol/L和 0.2μmol/L）。 每組所用 96孔板的孔數(shù) n=6。

1.5 指標(biāo)的檢測 1.5.1MTT檢測:將細胞按 1×104/mL密度接種于 96孔培養(yǎng)板 ,分組處理如前所述。加入 5g/L的MTT20μL,37℃孵育 4h,離心后去除上清液,加入 150μL DMSO振蕩 5min,使結(jié)晶物充分溶解,置入酶標(biāo)儀在 570nm檢測 A值。

1.5.2 LDH檢測:將細胞按 1×104/ml密度接種于 96孔培養(yǎng)板,分組處理如前所述。吸取待測 96孔板中的細胞培養(yǎng)液,按 LDH試劑盒說明書要求進行檢測。

1.5.3 :SOD活力及 MDA含量測定 將細胞以 106/ml的密度接種于 24孔板中,每孔 0.5mI,每組 5孔。收集細胞,超聲破碎細胞,離心后取上清待測,使用南京建成生物工程研究所檢測試劑盒,按說明書方法,測定 SOD活力及 MDA的含量。

1.5.4 流式細胞儀檢測凋亡:細胞培養(yǎng),分組處理如前所述。按 AnnexinV-FITC/PI試劑盒操作說明檢測細胞凋亡。用2.5g/L胰蛋白酶消化各組細胞,用 4℃預(yù)冷的 PBS洗滌 2次,離心(1000r/min,5min）后除去細胞碎片,用結(jié)合緩沖液重懸細胞,調(diào)節(jié)其細胞數(shù)為 1.0× 106/mL。取細胞懸液 100μL于 5 mL流式管中,加入 AnnexinV-FITC5μL和 2μg/mLPI 10μL,混勻后室溫避光孵育 15min,應(yīng)用流式細胞儀分析各組細胞凋亡率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行分析,所測值以均數(shù)±標(biāo)準差(±s）表示,組間比較采用單因素方差分析。 P＜0.05,認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果2.1 TMP對細胞活力的影響 經(jīng)各濃度TMP對正常大腦皮層神經(jīng)細胞活力檢測發(fā)現(xiàn),與正常細胞活力相比無差異(P＞ 0.05）,這說明 TMP在 0.05-0.2μmol/L的濃度范圍內(nèi)對正常培養(yǎng) PC12細胞沒有明顯影響。OGD-R后細胞活力由(100.13±9.72）%下降到(36.43± 5.87）%(P＜0.05）。 TMP可以減輕細胞損傷 ,按濃度 (0.05μmol/L、 0.1μmol/L、0.2μmol/L）其細胞活力分別提高到(45.21± 6.14）%,(64.22±7.81）%,(79.94±8.12）%,與 OGD-R組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。

2.2 TMP對細胞內(nèi) LDH的影響 結(jié)果如表 1所示,缺血能夠引起大腦皮層神經(jīng)細胞胞內(nèi) LDH釋放,再灌注時加入TMP,能夠抑制 LDH釋放,而且隨著藥物濃度增加 LDH釋放量減少。

2.3 TMP對細胞內(nèi) SOD及 MDA的影響 與對照組相比,OGD-R降低了 SOD活性,當(dāng)細胞再灌注加入 TMP處理后,SOD活性得到了明顯的提高。OGD-R后 MDA含量明顯增加,應(yīng)用 TMP治療可顯著降低其含量,且隨著藥物濃度增加MDA含量也明顯減少(表 1）。

2.4 TMP對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖細胞凋亡的影響 與對照組比較,OGD-R模型組細胞凋亡率明顯升高 (P＜0.01）。與模型組比較 ,TMP0.05μmol/L、 0.1μmol/L 和 0.2μmol/L 各濃度組細胞凋亡率降低,呈濃度依賴關(guān)系,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表 5）。

表1 TMP對細胞 LDH釋放、SOD活性及 MDA含量的影響

表2 TMP對細胞凋亡率的影響

討 論 整體動物模型研究由于易受體內(nèi)外多種因素影響,使一些藥物研究的結(jié)果很不穩(wěn)定,不利于藥物作用的正確評估。體外實驗采用神經(jīng)細胞原代培養(yǎng),模擬人體缺血缺氧狀態(tài)可以排除體內(nèi)干擾,探討缺血性神經(jīng)元損傷機制。模擬缺血性損傷的離體模型有多種方法,目前公認的是細胞缺氧合并培養(yǎng)基缺糖模型[4]。本實驗結(jié)果表明,氧糖剝奪模型可以較好的模擬體內(nèi)缺血性損傷,具有起效較快、比氰化物等使用安全的特點,是制作缺血模型和用于簡單藥物評價的有利方法。

川芎嗪系川芎等植物中分離的一種生物堿單體,化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪。近年研究發(fā)現(xiàn),TMP可透過血腦屏障,通過阻滯鈣離子通道、清除氧自由基、影響內(nèi)皮素和一氧化氮合成等對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生多種作用,其應(yīng)用價值得到廣泛承認[5]。已研究證明川芎嗪對中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血再灌注損傷有明顯保護作用[6～10]。但目前缺少離體細胞學(xué)的實驗證據(jù),且保護作用機制尚不清楚。

本實驗采用 MDA、SOD及 LDH等指標(biāo)觀察 TMP對缺氧缺糖 /復(fù)氧復(fù)糖損傷神經(jīng)細胞的影響。MDA是一種在缺氧狀態(tài)下生物膜中的多不飽和脂肪酸受自由基攻擊所形成的一種脂質(zhì)過氧化物,測定 MDA的量常?？煞从硻C體內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷的程度。SOD是以氧自由基連鎖反應(yīng)前體物 O2-為唯一底物的天然酶類清除劑,構(gòu)成了機體抗活性氧的第一道防線。MDA的高低間接反應(yīng)了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度,而 SOD活力的高低直接反應(yīng)了機體清除氧自由基的能力。乳酸脫氫酶(LDH）是一種細胞內(nèi)標(biāo)志酶,廣泛存在于各種組織細胞的胞漿中。當(dāng)細胞受損時,細胞膜通透性發(fā)生改變,LDH釋放量明顯增加。因而檢測 LDH漏出量能夠定量評價細胞損傷程度[11]。MTT為淡黃色粉末,易被水溶解和透過細胞膜被活細胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原,形成不溶于水的藍紫色結(jié)晶。該結(jié)晶可溶于 DMSO,通過分光光度計依顏色深淺可測定出各吸光度值,因此吸光度值大小可間接反映細胞存活數(shù)量及細胞活性。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖后細胞存活率降低,LDH釋放上升,SOD活性下降,MDA含量明顯增加;TMP可濃度依賴性地明顯提高缺氧缺糖 /復(fù)氧復(fù)糖損傷細胞的存活率和 SOD水平,減少 LDH釋放和 MDA含量。這提示 TMP能夠通過抗氧化作用發(fā)揮其對缺氧缺糖 /復(fù)氧復(fù)糖損傷細胞的保護作用。

缺血再灌注導(dǎo)致神經(jīng)細胞損傷的機理十分復(fù)雜,涉及鈣離子超載、細胞凋亡、能量代謝障礙、興奮性氨基酸增多等多種復(fù)雜因素。研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡與腦缺血、腦缺血再灌注及某些退行性神經(jīng)病變等有關(guān)[12～14]。其中,細胞凋亡是多種生理病理刺激引發(fā)的細胞自殺過程,是生物體內(nèi)普遍存在的不同于壞死的生理性細胞死亡。細胞凋亡是一個漸進的過程,凋亡早期的細胞結(jié)構(gòu)變化輕微,胞膜尚未破壞,此時通過治療干預(yù)手段仍能逆轉(zhuǎn)這部分細胞的功能。因此,針對早期凋亡細胞功能的保護作用,抑制凋亡過程的繼續(xù),才是藥物作用的關(guān)鍵靶點。本實驗采用培養(yǎng)的神經(jīng)細胞,建立缺氧損傷模型,應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳檢測到 DNA梯帶,通過流式細胞儀檢測,發(fā)現(xiàn) TMP可明顯降低再灌注損傷 PC12細胞凋亡率。提示 TMP對擬缺血再灌注PC12細胞的保護作用機制可能與其抑制凋亡有關(guān)。

綜上所述,川芎嗪對培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元在氧糖剝奪損傷中有保護作用,其保護機制可能與葛根素穩(wěn)定細胞膜,減輕氧化損傷,及抑制細胞凋亡有關(guān)。

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川芎嗪 /藥效學(xué) 大鼠 實驗研究

R28

A

1000-7369(2011）01-0108-04

△陜西省寶雞市華山醫(yī)院(寶雞 721000）

▲陜西省人民醫(yī)院(西安 710068）

(收稿 2010-08-09;修回 2010-09-12）