賀加雙,馬衛(wèi)明,鄧立新,宋移福,劉蓮蓮,曹永芝,謝 冰

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山東泰安 271018;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院,河南鄭州 450002)

早孕因子是哺乳動(dòng)物受精后最早在血清中檢測(cè)到的具有免疫抑制和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用的妊娠相關(guān)蛋白。它是一種免疫抑制因子和生長(zhǎng)因子,1974年由澳大利亞學(xué)者M(jìn)orton等[1]在孕鼠血清中首次發(fā)現(xiàn),由于在小鼠受精6 h后就可檢測(cè)到,因此被命名為早孕因子。此后,在妊娠婦女[2]、羊[3]、豬[4]、牛[5]等妊娠哺乳動(dòng)物母體內(nèi)相繼檢測(cè)到了EPF。目前普遍認(rèn)為EPF是熱激蛋白家族成員—伴侶蛋白10(Cpn-10)的同系物[6,7],是最早確認(rèn)妊娠的生化標(biāo)志之一,是防止母體對(duì)胚胎乃至胎兒發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的必需物質(zhì)[8]。由于它能增強(qiáng)抗淋巴細(xì)胞血清抑制 T淋巴細(xì)胞花環(huán)形成,可用花環(huán)抑制試驗(yàn)做生物學(xué)鑒定。在牛授精后盡早對(duì)其做妊娠診斷可以避免空懷,胚胎死亡后早孕因子會(huì)迅速下降,因此監(jiān)測(cè)早孕因子活性對(duì)肉牛產(chǎn)業(yè)意義重大,由于早孕因子在超早期妊娠診斷,腫瘤病的診斷,胚胎監(jiān)測(cè),治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎[9,10],流產(chǎn)預(yù)測(cè)等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值,因此成為研究的重點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 血樣的采集與處理

肉牛血樣采自山東省鄄城縣魯西黃牛保種繁殖基地。頸靜脈采血取11頭不同孕期孕牛(孕期1～2月5頭,3～5月4頭,6～9月2頭)和4頭未懷孕肉牛血液做對(duì)照。該15頭牛體重相當(dāng),營(yíng)養(yǎng)狀況和飼喂條件均一致。2 500 r/min離心20 min,分離血清,并在56℃下鈍化 30 min,分裝,-20℃保存?zhèn)溆?。采樣時(shí)已做妊娠診斷。

1.2 牛外周血淋巴細(xì)胞懸液的制備

采集健康肉牛血液,0.1%肝素鈉抗凝。加入等體積pH 7.4的PBS液,混勻,按每管4 mL輕輕疊加于盛有等量牛淋巴細(xì)胞分離液(D=1.086)的10 mL離心管中。2 000 r/min離心15 min。離心結(jié)束后,吸取分離液與血漿交界部位的灰白云霧層,用3倍體積的PBS液以2 500 r/min離心20 min。棄上清,沉淀洗滌2次,取l滴細(xì)胞懸液,用臺(tái)盼蘭拒染法鏡檢計(jì)數(shù)細(xì)胞,最后將細(xì)胞調(diào)整到2×106個(gè)/ mL,備用,并3 h內(nèi)使用。

1.3 綿羊紅細(xì)胞(SRBC)的制備

綿羊頸靜脈采血,0.1%肝素鈉抗凝,2 500 r/min離心15 min分離紅細(xì)胞。用PBS液洗5次,配成終濃度為1.5%。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 玫瑰花環(huán)形成率檢測(cè)

孕牛血清倍比稀釋成終體積為100 μ L。加等體積的淋巴細(xì)胞,37℃孵育 60 min,加 100 μ L 1.5%的綿羊紅細(xì)胞,37℃孵育5 min,2000 r/min離心2 min,室溫孵育40 min,輕輕重懸,20 μ L 10%的戊二醛固定,涂片,瑞氏染色,鏡檢。計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞形成的花環(huán)結(jié)構(gòu)。結(jié)合紅細(xì)胞少于3個(gè)的不計(jì)入。花環(huán)抑制滴度(RIT值)按花環(huán)數(shù)低于對(duì)照組75%的最高血清稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)計(jì)算。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS。

2 結(jié)果

2.1 玫瑰花環(huán)抑制滴度

懷孕1～9月肉牛玫瑰花環(huán)抑制滴度是8～10,而對(duì)照組花環(huán)滴度為3,顯著高于對(duì)照組,因此按此法做玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn)檢測(cè)肉牛的早孕因子活性,可以認(rèn)為滴度高于8為懷孕狀態(tài)(見(jiàn)表1)。

表1 不同孕期肉牛玫瑰花換抑制滴度(RIT值)

2.2 玫瑰花環(huán)形成情況

2.2.1 對(duì)照組 能形成完整的玫瑰花環(huán),結(jié)合紅細(xì)胞多,花環(huán)形成率高。詳見(jiàn)圖1,圖2。

2.2.2 懷孕牛組 淋巴細(xì)胞結(jié)合紅細(xì)胞少,花環(huán)不完整,花環(huán)形成率低,詳見(jiàn)圖3,圖4。

圖 1

圖2

圖 3

圖4

3 討論

隨著生物技術(shù)在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用,超早期妊娠診斷、評(píng)價(jià)胚胎的存活及其活力、分析早期胚胎丟失的原因等顯得尤為重要。EPF的發(fā)現(xiàn)為其提供了可能,通過(guò)Ea玫瑰花環(huán)形成抑制試驗(yàn),測(cè)定RIT值判別其存在與否,是目前對(duì)EPF的檢測(cè)的唯一方法,該方法一般需要制備抗淋巴細(xì)胞白蛋白(ALS),檢測(cè)ALS的最大稀釋倍數(shù)[11,12],用以計(jì)算RIT值。方法繁瑣,靈敏度差。本試驗(yàn)建立檢測(cè)抗淋巴血清的最大稀釋倍數(shù)來(lái)計(jì)算RIT值的方法,對(duì)試驗(yàn)步驟進(jìn)行了簡(jiǎn)化,宜于操作,簡(jiǎn)單可行。

EPF對(duì)妊娠母體具有很高的特異性。一旦妊娠終止,血清中EPF立即消失。通過(guò)本實(shí)驗(yàn),觀察到妊娠牛玫瑰花環(huán)抑制滴度顯著高于對(duì)照組未妊娠牛,是對(duì)照組的2倍多。在本實(shí)驗(yàn)中,玫瑰花環(huán)率高于8可以確認(rèn)牛懷孕,低于4可以認(rèn)為未懷孕。因此使用此法早期確認(rèn)牛是否懷孕是可行的。由于牛胚胎死亡以后,EPF含量迅速減少,所以也可以用來(lái)檢測(cè)胚胎狀態(tài)。

淋巴細(xì)胞和孕牛血清孵育之后,形成的玫瑰花環(huán)結(jié)合的紅細(xì)胞減少,可能是淋巴細(xì)胞和EPF作用時(shí),影響到牛T細(xì)胞膜上具有能和綿羊紅細(xì)胞膜上的糖蛋白相結(jié)合的受體。

由于玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn)需要的藥品試劑多,操作程序繁瑣,在生產(chǎn)中的大規(guī)模推廣受到了一定的限制,可以通過(guò)制備EPF單克隆抗體、多克隆抗體等手段,作出快速診斷試劑或試紙,則可直接檢測(cè) ,將為肉牛,乃至哺乳動(dòng)物的早期、超早期妊娠診斷開(kāi)創(chuàng)新的途徑。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)使用的檢測(cè)抗淋巴血清的最大稀釋倍數(shù)來(lái)計(jì)算RIT值的方法,對(duì)試驗(yàn)步驟進(jìn)行了簡(jiǎn)化,宜于操作,效果確實(shí)。

在本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),玫瑰花環(huán)抑制滴度高于8可以確認(rèn)牛懷孕,低于4可以認(rèn)為未懷孕。因此使用此法早期確認(rèn)牛是否懷孕具有可行性。

[1] Morton H,Hegh V,Chunie G.Immunosuppression detected in pregnant mice by the rosette inhibition test.Nature,1974,249 (456):459.

[2] Morton H,Rolfe B E,Cavanagh A C.Early pregnancy factor [J].Semin Reprod Endocrinol,1992,10:72-82.

[3] A thanasas-Platsis S,Morton H,Dunglison G F,et al.Antibodies to early pregnancy factor retard embryonic development in mice in vivo[J].J Reprod Fertil,1991,92:443-51.

[4] Athanasas-Platsis S,Corcoran C,Kaye P,et al.Early pregnancy factor is required at two important stages of embryonic development in the mouse[J].AJRI,2000,43:223-33.

[5] Noonan F P,Halliday W J.M orton Clunnie GIA:Early pregnancy facto r is immunosuppressive[J].Nature,1979,278:649-651.

[6] Esnglebretsen D R,Gamham B,Alewood P F.A cassette 1igation strategy with thioether replacenebt of three Ghy-Gly peptide bonds:total chemical sy nthesis of the lOl residue protein early pregnancy factor[psi(CH2S)28-29,56-57,76-77].J 0rg Chem.2002,67(17):5883.

[7] F1etcher B H,Cassad A I,Summers K M,et al.The murine chaperonin 10 gene fami1y contains an intronless,putative gene for early pregnancy facto r,Cpnl0-rs1.Mamm Genome,2001,12 (2):133.

[8] Clara Aranha,Arvind Bordekar,Savitri,et al.Isolation and purification of an early pregnancy factor-like molecule from culture supernatants obtained from lymphocy tes of pregnant women[J].Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 1998,(15):619-624.

[9] Jacqueline Harness,Alice Cavanagh,Halle M orton,et al.A protective effect of early pregnancy factor on experimental autoimmune encephalomyelitis induced in Lewis rats by inoculation with myelin basic protein[J].Journal of the Neurological Sciences,2003,216:33-41.

[10] Zhang B,Harness J,Somodevilla-Torres M J,et al.Early pregnancy factor suppresses experimental autoimmune encephalomyelitis induced in Lewis rats with myelin basic protein and in SJL/J mice with myelin proteolipid protein peptide[J].Neurol Sci,2000,182(1):5-15.

[11] 孫文東,張 堅(jiān),趙麗霞,等.早孕因子生物學(xué)活性的研究現(xiàn)狀和應(yīng)用前景[J].中華臨床醫(yī)藥,2004,5(17):56-58.

[12] 權(quán) 凱 ,張改平.應(yīng)用 Ea玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn)檢測(cè)奶牛血清EPF活性[J].中國(guó)奶牛,2008,26(6):29-31.