朱麗華 季錦衣 吳小芹 王張麗 葉建仁

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037)

一種制備無菌松材線蟲的方法1)

朱麗華 季錦衣 吳小芹 王張麗 葉建仁

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037)

報道了一種通過用H2O2處理松材線蟲卵進(jìn)而獲得無菌松材線蟲的方法。實驗結(jié)果表明，15％H2O2處理對松材線蟲卵有一定影響，隨著處理時間延長，松材線蟲孵化率下降，處理30min以上使其孵化率降低至10％以下;15％H2O2處理時間對獲得無菌松材線蟲有較大影響，其中，處理60min后獲得無菌線蟲的機(jī)率達(dá)70％。在無菌條件下，用無菌松材線蟲對赤松無菌組織培養(yǎng)幼苗進(jìn)行接種能使其發(fā)生萎蔫，表明采用該方法制備無菌松材線蟲并未使其失去致病性，是一種成功的方法。

松材線蟲;H2O2;無菌;致病性

松材線蟲病是松樹的一種毀滅性病害，對日本、韓國和中國等多個國家的松林及森林生態(tài)系統(tǒng)造成極大的危害并導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。長期以來松材線蟲[Bursaphelenchus xylophilus(Steiner＆Burher)Nickle]被認(rèn)為是該病的惟一病原[1-3]。Oku等[4]曾提出感病松樹的快速萎蔫可能與松材線蟲攜帶的細(xì)菌有關(guān)，以后又有一些研究者相繼報道松材線蟲體表攜帶有各種細(xì)菌[5-9]。有關(guān)細(xì)菌在松材線蟲致病過程中的作用引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。Kawazu等經(jīng)過研究提出松材線蟲病的真正病原是松材線蟲攜帶的致病細(xì)菌[10-11];洪英娣等和Han等報道松苗萎蔫與線蟲種類無關(guān)，而是由伴隨細(xì)菌的種類決定[12-13];趙博光等提出該病是松材線蟲和其攜帶致病細(xì)菌的復(fù)合侵染病害[14];談家金等則提出松材線蟲及其伴生細(xì)菌均是該病不可缺少的致病因素[15]。由上分析可見，松材線蟲病的病原及其致病機(jī)理至今尚未完全弄清。

由于松材線蟲體表攜帶有多種細(xì)菌，為了準(zhǔn)確研究松材線蟲及其攜帶細(xì)菌與寄主松樹間，以及松材線蟲與其攜帶細(xì)菌之間復(fù)雜的關(guān)系，對供試松材線蟲有著更高的要求，即需要使用不攜帶細(xì)菌的無菌松材線蟲。目前，已有不少關(guān)于松材線蟲無菌化方法的報道[7，10，16-17]，但這些方法通常需幾種試劑進(jìn)行反復(fù)處理，步驟比較復(fù)雜。本研究旨在建立一種簡便的培養(yǎng)無菌線蟲的方法，并對無菌松材線蟲的致病性進(jìn)行了測定。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試松材線蟲:試驗用松材線蟲蟲株為AMA3 C1、AMA3 D1及日本蟲株宮崎2，其中，AMA3 C1、AMA3 D1為采用全同胞兄妹交配的方式連續(xù)培養(yǎng)20代建立的近交系[18]，其親本為強(qiáng)毒松材線蟲蟲株AMA3。使用前均培養(yǎng)于灰葡萄孢(Botrytis cinerea)上。

供試松苗:赤松無性系10-4瓶內(nèi)組織培養(yǎng)幼苗，使用前于DCR活性炭培養(yǎng)基中培養(yǎng)3個月。

試劑:15％H2O2，使用前配制。

1.2 方法

1.2.1 松材線蟲卵的收集

將松材線蟲培養(yǎng)于灰葡萄孢上5～7d，采用貝爾曼漏斗法分離線蟲并收集于無菌的離心管中，離心，去上清;再用無菌水清洗，離心，重復(fù)3～5次，最終保留2～3mL線蟲懸浮液。將線蟲懸浮液置于無菌的蓋玻片及小培養(yǎng)皿(直徑2.5～3.0cm)中，于25℃下產(chǎn)卵。4～6h后，將線蟲徹底清洗干凈，獲得純凈的松材線蟲卵，備用。

1.2.2 H2O2對松材線蟲卵孵化的影響

于無菌條件下將載有松材線蟲卵的凹玻片置于15％H2O2中浸泡，分別于10～60min后取出，用無菌水清洗3次;于凹槽中加入少量無菌水后置于無菌的大培養(yǎng)皿中，25℃下培養(yǎng)。24h后，于顯微鏡下檢查卵的孵化情況，未經(jīng)15％H2O2處理的為對照。重復(fù)3次以上。

1.2.3 無菌松材線蟲的培養(yǎng)及檢驗

將載有松材線蟲卵的小培養(yǎng)皿置于無菌的大培養(yǎng)皿中，加入新配制的15％H2O2將其淹沒，分別于浸泡10～60min后取出，用無菌水清洗3次后，加入少量無菌水將卵淹沒，將其置于無菌的大培養(yǎng)皿中，于25℃下培養(yǎng)，30h后于無菌條件下用移液器將小培養(yǎng)皿中孵化的線蟲轉(zhuǎn)入灰葡萄中皿。未經(jīng)15％H2O2處理的為對照。

待線蟲將灰葡萄孢吃盡，于無菌條件下用滅菌的漏斗、止水夾、面巾紙將線蟲收集于無菌的離心管中，離心，保留2～3mL。取1mL線蟲液至研缽中，加石英砂研磨后涂布營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)平板，或取200μL線蟲液與熔化至50℃左右的NA培養(yǎng)基混合倒平板。平板置于30℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)，3d后觀察NA平板的染菌情況，統(tǒng)計染菌率。每處理重復(fù)3次以上。

1.2.4 無菌松材線蟲的致病力測定

于無菌條件下將組培苗取出，切去頂梢后，接種于新鮮的DCR活性炭培養(yǎng)基中，將無菌棉球置于傷口處，用微量進(jìn)樣器注入無菌或帶菌松材線蟲懸液20μL，約含線蟲200條，無菌水為對照。30℃下培養(yǎng)，逐日觀察發(fā)病情況，統(tǒng)計感病率。每處理接種18～22株苗，重復(fù)2次。

1.2.5 接種松材線蟲的再分離及無菌線蟲的再檢驗

接種20d后，將感病植株取出，用剪刀將其針葉和莖段剪成2～4mm長短的小段，用貝爾曼漏斗進(jìn)行線蟲的再分離，24h后對其數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計。其中，無菌線蟲接種的植株在無菌條件下進(jìn)行線蟲的再分離。采用兩種方法對接種后的無菌松材線蟲的無菌情況進(jìn)行再檢驗，即取無菌條件下分離出的線蟲懸液200μL與熔化至50℃左右的NA培養(yǎng)基混合倒平板，或直接將植株剪碎于NA平板上，并滴加1mL無菌水。培養(yǎng)條件同前。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2對松材線蟲卵的影響

顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，H2O2處理對松材線蟲卵有較大影響。未經(jīng)H2O2處理的松材線蟲卵大部分能正常發(fā)育;15％H2O2處理可抑制卵的發(fā)育，致使其停留于某一發(fā)育階段或?qū)е禄翁バ纬?，使其不能正常孵化，甚至卵殼破損，卵內(nèi)物質(zhì)泄漏出外。孵化率檢查結(jié)果表明，隨著H2O2處理時間的延長，松材線蟲卵的孵化率逐漸下降。15％H2O2處理10min，卵孵化率降低至35.3％，當(dāng)處理時間超過30min后，孵化率降至10％以下，與對照相比差異顯著(表1)。

2.2 H2O2處理時間對松材線蟲無菌化的影響

實驗對松材線蟲近交系A(chǔ)MA3 C1和AMA3 D1及日本蟲株宮崎2的卵進(jìn)行了無菌化處理。NA培養(yǎng)基檢驗結(jié)果表明，15％H2O2處理時間對無菌松材線蟲的獲得至關(guān)重要。15％H2O2處理時間短于50min，未能徹底殺死松材線蟲卵表面的細(xì)菌，3個蟲株所孵化的線蟲均100％帶菌。處理50min的9個重復(fù)中，4個完全無菌，無菌率為44.4％;處理60min的10個重復(fù)中，7個完全無菌，無菌率達(dá)70％(表2)。由于15％H2O2處理時間過長會影響卵的孵化，因此，15％H2O2處理時間應(yīng)控制在60min左右。

在NA培養(yǎng)基上，未經(jīng)H2O2處理或處理不徹底的松材線蟲卵所培育的線蟲留下大量細(xì)菌菌落(圖1a，b)，而無菌線蟲研磨液涂布的NA培養(yǎng)基上無任何細(xì)菌菌落，無菌線蟲與NA培養(yǎng)基混合的平板上留下無數(shù)清晰的線蟲爬行軌跡(圖1c，d)。

表1 15％H2O2處理對松材線蟲卵孵化的影響

表2 15％H2O2處理時間對松材線蟲無菌化的影響

圖1 松材線蟲在NA培養(yǎng)基上留下的軌跡

2.3 無菌松材線蟲的致病力

于無菌條件下用本研究獲得的無菌松材線蟲和普通帶菌松材線蟲對無菌赤松組培苗進(jìn)行接種，均能使其發(fā)病。赤松組培苗接種線蟲后，最早于第5天表現(xiàn)出感病癥狀。無菌松材線蟲和帶菌松材線蟲所致萎蔫癥狀表現(xiàn)一致，均為針葉先褪色、黃化，進(jìn)而枯萎變成紅褐色。再分離結(jié)果表明，用無菌松材線蟲和帶菌松材線蟲接種無菌組培苗后，在發(fā)生萎蔫的組培苗體內(nèi)均能再分離出松材線蟲。

2.4 接種無菌松材線蟲致萎植株上再分離線蟲的無菌再檢驗

取再分離自無菌松材線蟲接種致萎赤松組培苗的19個線蟲樣以及10株赤松組培苗剪碎后在NA平板上于30℃下培養(yǎng)3d以上。結(jié)果表明，用無菌松材線蟲對赤松組培苗進(jìn)行接種未感染上任何細(xì)菌。

3 結(jié)論與討論

本研究建立了一種通過消毒松材線蟲卵從而獲得無菌線蟲的培養(yǎng)方法。

根據(jù)已有的知識，植物寄生線蟲的口針比較小，所以體內(nèi)沒有細(xì)菌[19]。利用透射電鏡對松材線蟲各部分進(jìn)行詳細(xì)觀察，未在線蟲體內(nèi)的任何部位觀察到細(xì)菌[6]。因此，很多無菌化的方法是采用對松材線蟲直接進(jìn)行表面消毒以獲得無菌線蟲[7，13-17，20]。由于松材線蟲體表存在大量細(xì)菌，因此難以徹底滅菌，要達(dá)到完全無菌，步驟通常比較繁瑣，如賁愛玲等報道用H2O2和抗菌素交替并反復(fù)處理松材線蟲才能獲得無菌松材線蟲，即用5％H2O2浸泡5min，無菌水離心換洗3次，加入抗菌素混合液(青霉素、鏈霉素、慶大霉素液)浸泡60min，離心洗滌，再用抗菌素混合液浸泡60min，重復(fù)3次，最終無菌率達(dá) 18％[17]。

Iwahori等曾報道用0.5％硫柳汞和0.5％鏈霉素混合液處理松材線蟲卵20min獲得無菌線蟲的方法[21]。Kawazu等參照Iwahori等的方法進(jìn)行無菌線蟲的制備，發(fā)現(xiàn)用0.5％硫柳汞和0.5％鏈霉素處理松材線蟲卵20min所培養(yǎng)出的線蟲并非完全無菌，隨后用0.5％硫柳汞、0.1％鏈霉素分別再處理15、30min，3次處理后的線蟲未能達(dá)到完全無菌，又用0.5％鏈霉素處理15min，最終獲得無菌線蟲[10]。本研究采用15％H2O2對松材線蟲卵進(jìn)行浸泡60min，獲得了比較好的效果，無菌線蟲獲得率達(dá)70％。由于用15％H2O2處理時間過長會對松材線蟲卵的孵化率造成一定影響，故15％H2O2處理時間并非越長越好，而應(yīng)控制在一定的范圍內(nèi)。

與以往一些報道[10，12，14-15]相比，采用 H2O2消毒松材線蟲卵所獲得的無菌松材線蟲依然能使無菌赤松組培苗發(fā)病，表明采用該方法對松材線蟲進(jìn)行無菌化處理并未使其失去致病性。其間的差異是否與進(jìn)行無菌化所采用的方法和試劑不同有關(guān)尚待進(jìn)一步研究。

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A Method for Obtaining Aseptic Pine Wood Nematode

/Zhu Lihua，Ji Jinyi，Wu Xiaoqin，Wang Zhangli，Ye Jianren(College of Forest Resources and Environment，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，P.R.China)//Journal of Northeast Forestry University.-2011，39(6).-65～67，71

Bursaphelenchus xylophilus;Hydrogen peroxide;Asepticism;Pathogenicity

S763

1)國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(2009CB119200)，江蘇省博士后基金(0802048C)，江蘇省有害生物入侵預(yù)防與控制重點實驗室開放基金項目(PMIS200802)。

朱麗華，女，1970年10月生，南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，講師。

葉建仁，南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，教授。E- mail:jrye@njfu.com.cn。

2011年1月7日。

責(zé)任編輯:戴芳天。

This paper describes a method for obtaining aseptic pine wood nematode(Bursaphelenchus xylophilus)by egg disinfection.Results showed that 15 percent hydrogen peroxide had a profound effect on egg hatching of pine wood nematode.The hatching rate of the pine wood nematode decreased with the prolonged processing time，and it decreased to less than 10 percent by soaking the eggs in 15 percent hydrogen peroxide for more than 30min.The obtained aseptic pine wood nematode was obviously influenced by egg processing time in 15 percent hydrogen peroxide，and the probability of obtaining aseptic pine wood nematode was up to 70 percent after processing for 60min.The microcuttings of Pinus densiflora were inoculated with aseptic pine wood nematode under aseptic conditions，which resulted in the wilt of microcuttings.It showed that the asepsis did not cause the pine wood nematode to lose its pathogenicity.