溫景輝 申海林 鄒利人 陳 蕾 劉洪章

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春，130118) (吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院) (吉林農(nóng)業(yè)大學(xué))

山葡萄核心種質(zhì)初步構(gòu)建1)

溫景輝 申海林 鄒利人 陳 蕾 劉洪章

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春，130118) (吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院) (吉林農(nóng)業(yè)大學(xué))

采用擴(kuò)增穩(wěn)定且譜帶清晰的18對(duì)SSR引物，對(duì)360份山葡萄資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。用逐級(jí)壓縮法選擇核心種質(zhì)，比較了樣本數(shù)不同的5個(gè)核心樣本群的等位基因數(shù)、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性和Shannon’s信息指數(shù)等參數(shù)，最終選擇了79個(gè)樣本組成的樣本群作為核心種質(zhì)。用DPS軟件對(duì)初始種質(zhì)和核心種質(zhì)群體的有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性和Shannon’s信息指數(shù)分別作t測(cè)驗(yàn)，核心種質(zhì)保留了初始種質(zhì)21.9％的樣品，等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數(shù)的保留率分別為94.1％、106.3％、101.9％、102.2％，核心種質(zhì)能很好地代表初始種質(zhì)。

山葡萄(Vitis amurensis Rupr.);種質(zhì)資源;遺傳多樣性;SSR;核心種質(zhì)

植物遺傳資源是新品種選育和種質(zhì)創(chuàng)新的基礎(chǔ)，種質(zhì)資源的收集、保存、評(píng)價(jià)和利用非常重要[1-2]。Hintum 等[3]認(rèn)為核心種質(zhì)庫(kù)能以最少的種質(zhì)材料代表一個(gè)種及野生近緣種的形態(tài)特征、地理分布、基因與基因型最大范圍的遺傳多樣性，可作為有利基因挖掘、新技術(shù)應(yīng)用和資源深入研究的優(yōu)先樣品集，能夠提高種質(zhì)資源的利用效率。然而，數(shù)量龐大的種質(zhì)資源不便于優(yōu)良種質(zhì)的保存、評(píng)價(jià)和利用，尤其是多年生木本果樹植物，個(gè)體占用土地面積較大、管理費(fèi)用較高，不便于種質(zhì)資源的有效管理和深入研究。

DNA分子標(biāo)記數(shù)據(jù)能夠直接反映出DNA序列水平上的變化，具有多態(tài)性高、不受環(huán)境影響和基因表達(dá)與否的限制等特點(diǎn)，近年來(lái)逐漸成為檢測(cè)植物種質(zhì)遺傳多樣性、構(gòu)建高質(zhì)量核心種質(zhì)的有效特征數(shù)據(jù)。目前已在芝麻[4-5]、水稻[6]、大豆[7]、豌豆[8]、桃[9]、果梅[10]等植物上建立了核心種質(zhì)，但利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)我國(guó)山葡萄資源進(jìn)行核心種質(zhì)構(gòu)建鮮有報(bào)道。筆者以中國(guó)農(nóng)科院左家特產(chǎn)研究所的國(guó)家山葡萄資源圃現(xiàn)存的360份山葡萄資源為材料，采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，初步構(gòu)建了山葡萄種質(zhì)資源核心種質(zhì)，旨在為今后山葡萄種質(zhì)資源的開發(fā)利用和遺傳育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試山葡萄資源360份由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所國(guó)家果樹種質(zhì)山葡萄資源圃提供。

1.2 分子標(biāo)記方法

采用SSR方法進(jìn)行遺傳多樣性分析。SSR標(biāo)記技術(shù)見(jiàn)文獻(xiàn)[11]。引物序列由東北林業(yè)大學(xué)提供，上海生工合成。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚類分析采用Ntsys統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)處理采用EXCEL電子表格。每個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，以1和0記錄等位基因的有和無(wú)。

1.3 核心種質(zhì)的遺傳多樣性評(píng)價(jià)參數(shù)

選擇等位基因數(shù)、等位基因頻率(pi)、有效等位基因數(shù)(A)、Nei’s遺傳多樣性(H)、Shannon’s多樣性信息指數(shù)(I)等指標(biāo)評(píng)價(jià)核心種質(zhì)的遺傳多樣性[11]。

1.4 核心種質(zhì)構(gòu)建方法

本試驗(yàn)采用多次聚類結(jié)合優(yōu)先取樣法，其具體原理如下:首先判斷處于最低分類水平的每組兩個(gè)遺傳材料的性狀是否具有極端表現(xiàn)，并優(yōu)先選取具有極端表現(xiàn)的個(gè)體。如果兩個(gè)體性狀都具有極端表現(xiàn)，則兩個(gè)個(gè)體都被優(yōu)先選入核心庫(kù)，如果都不具有極端的表現(xiàn)則采用隨機(jī)取樣的方法剔除其中一個(gè)。對(duì)資源多次聚類，采用逐級(jí)壓縮方法，建立樣本群，直到代表性或核心種質(zhì)達(dá)到要求，組成核心群體。

用上述方法分別抽取292、204、134、79、53個(gè)樣品組成核心樣本群進(jìn)行分析比較，樣品群代號(hào)分別為1、2、3、4、5。

1.5 核心種質(zhì)數(shù)據(jù)分析

將從SSR標(biāo)記中得到的原始數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，通過(guò)EXCEL電子表格計(jì)算各樣本群的等位基因數(shù)、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性和 Shannon’s信息指數(shù)，并用DPS(v7.05版)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行t測(cè)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 各樣本群的遺傳多樣性比較

根據(jù)評(píng)價(jià)遺傳多樣性公式，采用EXCEL電子表格計(jì)算得出了各樣本群的等位基因數(shù)、等位基因保留率、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。比較不同取樣數(shù)目所獲得的各種遺傳參數(shù)，可知樣本群4代表的79份樣品除等位基因頻率低于樣本群5外，有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性和 Shannon’s信息指數(shù)都是最高的，應(yīng)把79份樣本作為核心種質(zhì)。

表1 各樣本群的遺傳多樣性比較

2.2 初始種質(zhì)與核心種質(zhì)比較

初始種質(zhì)與核心種質(zhì)的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可看出核心種質(zhì)保留了初始種質(zhì)21.9％的樣品，等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數(shù)的保留率分別為94.1％、106.3％、101.9％、102.2％。

表2 核心種質(zhì)與初始種質(zhì)遺傳多樣性比較

用DPS軟件對(duì)2個(gè)群體的有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數(shù)分別作t測(cè)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3?？梢钥闯龊诵姆N質(zhì)的有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數(shù)在概率0.05水平上與初始種質(zhì)差異不顯著，可見(jiàn)核心種質(zhì)能很好的代表初始種質(zhì)群體基因型值的多樣性。

表3 初始種質(zhì)與核心種質(zhì)t測(cè)驗(yàn)結(jié)果

2.3 保留種質(zhì)與核心種質(zhì)比較

保留種質(zhì)即原始種質(zhì)除去核心種質(zhì)后保留下來(lái)的種質(zhì)資源，這部分種質(zhì)作為后備資源，當(dāng)在核心種質(zhì)中無(wú)法找到所需性狀時(shí)，就可從保留種質(zhì)中尋找。核心種質(zhì)與保留種質(zhì)的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 核心種質(zhì)與保留種質(zhì)遺傳多樣性對(duì)比

用DPS軟件對(duì)核心種質(zhì)和保留種質(zhì)的有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數(shù)分別做t測(cè)驗(yàn)，結(jié)果如表5。可以看出，在概率0.05水平上核心種質(zhì)的有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性和Shannon’s信息指數(shù)與保留種質(zhì)差異不顯著。但從表4可知核心種質(zhì)的有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數(shù)均高于保留種質(zhì)，應(yīng)該優(yōu)先使用。

表5 核心種質(zhì)與保留種質(zhì)t測(cè)驗(yàn)結(jié)果

2.4 山葡萄資源核心種質(zhì)主要性狀

79份核心種質(zhì)中包含兩性花、雌能花和雄株3個(gè)類群。其中兩性花31份，占兩性花樣本的21.7％;雌能花46份，占雌能花樣本的21.7％;雄株2份，占雄株樣本的40％。

3 討論

3.1 核心種質(zhì)的代表性、異質(zhì)性和多樣性

構(gòu)建核心種質(zhì)時(shí)要選擇有代表性、異質(zhì)性和多樣性、類型齊全的樣本作為核心種質(zhì)。本研究采用SSR標(biāo)記方法構(gòu)建的核心種質(zhì)中，不僅包含野生資源、人工培育品種(系)2大類，而且包含某些特殊性狀的種質(zhì)，如除兩性花外，還有雌能花和雄株等。初始種質(zhì)與核心種質(zhì)相比，有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數(shù)分別經(jīng)t測(cè)驗(yàn)差異不顯著;同時(shí)，核心種質(zhì)的有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數(shù)也均高于保留種質(zhì)。這說(shuō)明所構(gòu)建的79份核心種質(zhì)是山葡萄資源遺傳多樣性很高的種群，具有很好的代表性。

3.2 核心種質(zhì)的構(gòu)建方法

以往核心種質(zhì)的構(gòu)建多采用形態(tài)學(xué)方法[4-8]構(gòu)建，形態(tài)農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)作為研究核心樣品的指標(biāo)，有簡(jiǎn)便和研究費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)，但易受環(huán)境和基因顯隱性的影響。自分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于植物遺傳資源研究以來(lái)，RFLP、RAPD、AFLP、SSR等標(biāo)記已經(jīng)逐漸成為評(píng)價(jià)植物資源多樣性、構(gòu)建核心種質(zhì)的有效方法。本研究運(yùn)用SSR標(biāo)記，成功地初步構(gòu)建了360份山葡萄資源的核心種質(zhì)，具有一定應(yīng)用價(jià)值。分子標(biāo)記能從DNA水平檢測(cè)材料的遺傳差異，但分子標(biāo)記不是直接控制形態(tài)一農(nóng)藝性狀變異的基因，僅用分子標(biāo)記研究核心種質(zhì)也存在著不足。如何整合這兩類數(shù)據(jù)構(gòu)建核心種質(zhì)是核心種質(zhì)研究中仍需解決的問(wèn)題。

3.3 核心種質(zhì)的取樣比例

在國(guó)內(nèi)外不同植物核心種質(zhì)庫(kù)的構(gòu)建中總體取樣比例為該物種總資源的5％～30％，或總量不超過(guò)3 000份[12]。由于生物進(jìn)化及人工選擇對(duì)作物的干預(yù)，產(chǎn)生了各個(gè)物種獨(dú)特的特性，對(duì)整體取樣比例的確定不能格式化、簡(jiǎn)單化，應(yīng)視研究作物的遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性而定。目前，在已構(gòu)建的多種果樹資源核心種質(zhì)的取樣比例均較高，取樣比例為10％～30％。其中，張春雨[13]利用SSR標(biāo)記構(gòu)建的新疆野蘋果核心資源取樣比例為22.9％，劉勇[14]等構(gòu)建的柚類核心資源取樣比例為22.73％，程麗莉[15]構(gòu)建的燕山地區(qū)實(shí)生板栗核心種質(zhì)取樣比例為27.2％，高志紅[16]構(gòu)建的果梅核心資源取樣比例為10％，馬玉敏[17]構(gòu)建的野生板栗核心資源取樣比例為20％。在本研究中，通過(guò)采用SSR分子標(biāo)記，經(jīng)過(guò)遺傳多樣性評(píng)價(jià)和顯著性t測(cè)驗(yàn)，確定了我國(guó)山葡萄資源核心種質(zhì)合適的取樣比例為初始種質(zhì)的21.9％。

4 結(jié)論

采用SSR分子標(biāo)記，選擇組內(nèi)聚類逐步壓縮取樣方法，對(duì)360份山葡萄資源進(jìn)行核心種質(zhì)構(gòu)建，獲得了包含79份資源的核心種質(zhì)。核心種質(zhì)保留了初始種質(zhì)21.9％的樣品，等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數(shù)的保留率分別為94.1％、106.3％、101.9％、102.2％，核心種質(zhì)能很好的代表初始種質(zhì)群。

致謝:感謝中國(guó)農(nóng)科院特產(chǎn)研究所提供試驗(yàn)材料及農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)，感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)王軍教授提供引物序列，特此致謝。

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Primary Establishment of Core Collection of Vitis amurensis in Northeast China

/Wen Jinghui(School of Life Sciences，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，P.R.China);Shen Hailin，Zou Liren，Chen Lei(Jilin Academy of Agricultural Sciences);Liu Hongzhang(Jilin Agricultural University)//Journal of Northeast Forestry University.-2011，39(6).-35～37

Vitis amurensis;Germplasm resources;Genetic diversities;SSR;Core collections

S663.1

1)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助(nycytx-30)。

溫景輝，男，1963年10月生，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，博士研究生，工作于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，研究員。

劉洪章，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，教授。E-mail:lhz999@126.com。

2010年12月17日。

責(zé)任編輯:戴芳天。

Eighteen pairs of SSR primers with steady amplification and clear spectrum were used to analyze the genetic diversity of 360 accessions of Vitis amurensis Rupr.in northeast China.Stepwise condensation method was used to screen the core collection.A total of 79 samples were chosen as core collection by comparing the parameters of 6 sample groups，including number of alleles，allele frequency，effective number of alleles，Nei’s genetic diversity，and Shannon information index.T-test for initial collection and core collection was performed by using DPS software.Results showed that the core collection hold 21.9 percent of samples of initial collection，and the number of alleles，the effective number of alleles，Nei’s genetic diversity，and Shannon information index reached 94.1％，106.3％，101.9％and 102.2％respectively.It is demonstrated that the core collection can express initial collection well.