顏 軍， 侯賢燈， 徐開來

（1．四川大學(xué)化學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064；2．成都大學(xué)中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610106）

柱前衍生HPLC分析銀耳多糖的單糖組成

顏 軍1，2， 侯賢燈1， 徐開來1

（1．四川大學(xué)化學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064；2．成都大學(xué)中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610106）

建立1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生高效液相色譜法分離檢測(cè)5種單糖的方法。根據(jù)單糖PMP衍生物的峰面積大小，對(duì)衍生化反應(yīng)中反應(yīng)時(shí)間、PMP與NaOH的量、中和溫度和鹽酸用量進(jìn)行了考察，從而得到較佳的衍生化樣品制備條件。以20mmol·L-1磷酸鹽緩沖液-乙腈為流動(dòng)相，考察了pH值和乙腈體積分?jǐn)?shù)對(duì)糖衍生物分離的影響，確定最佳pH值為6.72，最佳乙腈體積分?jǐn)?shù)為18%，并將該方法應(yīng)用于銀耳酸性多糖的單糖組成的測(cè)定。

單糖；多糖；高效液相色譜；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮

1 引 言

銀耳在我國已有悠久的藥用和食用歷史。近年來，對(duì)銀耳的化學(xué)成分及藥理活性所進(jìn)行的研究和大量的現(xiàn)代藥理證明，多數(shù)藥理活性都與銀耳多糖有關(guān)，特別是酸性銀耳多糖。成都大學(xué)中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室對(duì)銀耳多糖進(jìn)行了分離純化，得到了酸性銀耳多糖純品TPP2[1]。而多糖的單糖組成測(cè)定則是控制多糖質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和提供多糖基本信息的重要環(huán)節(jié)。

由于單糖分子的多樣性，關(guān)于糖的分析方法仍在不斷發(fā)展。單糖組分的色譜分離測(cè)定方法目前主要有高效液相色譜法（HPLC）[2-3]、氣相色譜法（GC）[4-5]、薄層色譜法（TLC）[6]等。采用GC測(cè)定糖類，由于糖本身沒有足夠的揮發(fā)性，所以必須在氣相色譜分析之前預(yù)先轉(zhuǎn)化成易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性較強(qiáng)的衍生物，分析過程較為復(fù)雜。另外，在糖衍生物的制備過程中，又常會(huì)產(chǎn)生衍生物的異構(gòu)體，在色譜分析時(shí)每種糖可能會(huì)產(chǎn)生幾個(gè)峰，這往往影響組分的分離和定量測(cè)定。

采用HPLC分析單糖組成的難點(diǎn)在于單糖本身沒有紫外吸收，人們常將多糖水解后采用柱前或柱后衍生化色譜法分離和檢測(cè)，以改善其分離選擇性和提高檢測(cè)靈敏度。在眾多的衍生化方法中，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化高效液相色譜法因反應(yīng)條件較溫和、產(chǎn)物無立體異構(gòu)、紫外檢測(cè)靈敏度較高，得到較為廣泛的應(yīng)用[7]。該文選取PMP作為柱前衍生化試劑，用高效液相色譜法分離檢測(cè)5種單糖，通過對(duì)衍生化條件的考察以及色譜分離條件的選取，建立了銀耳多糖的單糖組成分離測(cè)定方法，具有較好的實(shí)用意義。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

日立LC-2000高效液相色譜儀，包括L-2130二元泵，L-2450 DAD檢測(cè)器。

衍生化試劑：1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），純度 99%（美國 Acros Organics公司）；乙腈（色譜純，成都科龍化工試劑廠）；鹽酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

單糖標(biāo)準(zhǔn)品：葡萄糖（Glc，99%）、甘露糖（Man，99%）、半乳糖（Gal，≥99%）、鼠李糖（Rham，≥99%）、木糖（Xyl，98%）均購于上?；瘜W(xué)試劑公司；超純水；其他試劑均為分析純。

銀耳酸性多糖TPP2由成都大學(xué)中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制[1]。

2.2 混合單糖標(biāo)樣的衍生

分別取200μL的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)液（各單糖摩爾濃度均為 1mmol·L-1）與 120μL 的 0.25mol·L-1NaOH溶液，加120μL 0.50mol/L的PMP甲醇溶液，置于5mL的具塞試管中漩渦混勻；在70℃水浴中反應(yīng)90min；取出置冷水浴中 10min；加 120μL 0.30mol·L-1的HCl中和；再加2mL的氯仿，振搖，靜置，棄去氯仿相，如此萃取3次。將水相用0.45μm微孔膜過濾后供HPLC進(jìn)樣分析。

2.3 樣品制備

吸取1mL質(zhì)量濃度為4～5 g·L-1的多糖樣品溶液于安瓿瓶中，加入100μL的2.00mol·L-1H2SO4，充N2封管，110℃烘箱中水解2h[3]。冷卻后，NaOH溶液中和至中性，然后按“2.2”法進(jìn)行衍生化反應(yīng)。

2.4 色譜條件

色譜柱：大連江申 C18，250mm×4.6mm，5μm；流動(dòng)相：20mmol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH 6.72）-乙腈（ν∶ν 為 82∶18）；柱溫：30℃；檢測(cè)波長：250 nm；流速：1mL·min-1；進(jìn)樣體積：20μL。

3 結(jié)果與討論

3.1 流動(dòng)相pH及乙腈體積分?jǐn)?shù)對(duì)分離的影響

反相分離單糖PMP衍生物時(shí)，常以緩沖液-乙腈為流動(dòng)相。該文首先考察了乙腈比例（15%、18%、21%）對(duì)上述5種單糖在C18柱上的保留值及分離效果的影響。結(jié)果顯示，15%乙腈時(shí)半乳糖和木糖衍生物出峰太遲且峰較寬；21%乙腈時(shí)甘露糖衍生物峰與PMP峰重疊無法分開，同時(shí)半乳糖和木糖衍生物峰的分離也不佳；而乙腈的體積分?jǐn)?shù)為18%時(shí)分離較好（見圖1）。此外，緩沖液的pH對(duì)糖衍生物的分離也是一重要的影響因素。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了醋酸緩沖液（pH 5.43）和磷酸緩沖液（pH 6.72）對(duì)各種糖衍生物的保留值及分離效果的影響。結(jié)果表明，采用pH為6.72的磷酸緩沖液時(shí)分離效果最佳，分析時(shí)間較短，出峰間距較均勻。因此，確定流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液（pH 6.72）-乙腈（ν∶ν 為 82∶18）。該文方法不需梯度洗脫即可同時(shí)實(shí)現(xiàn)5種單糖衍生物的分離，且分離效果較好。

圖1 衍生樣品色譜圖

3.2 PMP與NaOH的量對(duì)衍生化反應(yīng)的影響

在衍生化反應(yīng)中，為了保證單糖完全反應(yīng)，一般采用PMP的量大大超過理論所需量。實(shí)驗(yàn)中，取200μL的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)液（各單糖濃度均為1mmol·L-1）加120μL 0.50mol·L-1的PMP甲醇溶液，控制PMP的量為混合單糖總量的60倍；然后分別加入30μL，60μL，90μL，120μL，200μL 的 0.25mol·L-1NaOH溶液，按“2.2”條件制備樣品。色譜分析結(jié)果表明，NaOH溶液加入量為120μL時(shí)各種糖的PMP衍生產(chǎn)物的峰面積均為最大值，故確定NaOH溶液加入量為 120μL。

3.3 衍生化反應(yīng)時(shí)間的選擇

在其他條件（如“2.2”所述）相同情況下，將混合單糖標(biāo)樣分別采用 30min，60min，90min，120min 的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行衍生化反應(yīng)，考察衍生化糖峰的峰面積大小變化。結(jié)果表明，反應(yīng)時(shí)間為90min時(shí)，各種糖的PMP衍生產(chǎn)物的峰面積均為最大值，故衍生化反應(yīng)時(shí)間選為90min。

3.4 中和溫度的影響

由于在衍生化反應(yīng)中PMP大大過量且在色譜分離中有一定的影響[2]，所以衍生反應(yīng)完成后，需要用氯仿萃取去除過量的PMP。但糖的PMP衍生產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有堿性基團(tuán)，在pH值較高時(shí)不解離，因而易被氯仿萃取而損失，所以在萃取前應(yīng)中和反應(yīng)體系中的堿。在文獻(xiàn)[7]中一般都采用冷卻至室溫。在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中發(fā)現(xiàn)室溫是一個(gè)很不確定的溫度，比如夏季與冬季的室溫差在20℃以上，這個(gè)差異導(dǎo)致了中和反應(yīng)衍生化產(chǎn)物的不穩(wěn)定，對(duì)樣品分析和含量測(cè)定產(chǎn)生了很大的影響。因此，對(duì)靜置冷卻至室溫（體系實(shí)測(cè)溫度為32℃）與用冷水浴冷卻10min（體系實(shí)測(cè)溫度為12℃）兩個(gè)中和溫度條件進(jìn)行了比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，冷水浴冷卻10min后中和的溫度條件的色譜分析效果非常好，而室溫冷卻的色譜分析效果很差。主要表現(xiàn)在單糖衍生物峰面積大幅減小和死時(shí)間附近的有色物質(zhì)峰面積大大增加。這是因?yàn)閱翁茄苌锊环€(wěn)定，在較高溫度條件下中和，由于酸的影響產(chǎn)生了部分衍生化不完全產(chǎn)物，導(dǎo)致單糖衍生物峰面積減小。這部分物質(zhì)由于極性較強(qiáng)，所以不保留或保留較弱，峰出現(xiàn)在死時(shí)間附近。

3.5 酸度對(duì)萃取效果的影響

實(shí)驗(yàn)中考察比較了不同體積（120μL，150μL，180μL，210μL）的HCl（0.3mol·L-1）中和后的萃取效果。結(jié)果表明，使用120μL的鹽酸中和即可，此時(shí)體系的pH值為5.64。萃取后大多數(shù)單糖PMP衍生物的峰面積較大，且5種糖衍生物的總的峰面積最大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pH值（鹽酸用量）對(duì)糖的PMP衍生物在萃取過程中的損失有一定的影響。pH值＞7，不利于單糖PMP衍生物的解離，因而在氯仿中有一定的溶解度，萃取中的損失較顯著。pH值太低（＜4）也會(huì)增大單糖衍生物的損失，這是由于在酸性條件下衍生產(chǎn)物不太穩(wěn)定所致。因此，應(yīng)合理調(diào)節(jié)體系的pH值在5～6范圍內(nèi)。

3.6 萃取次數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)中采用2mL的氯仿進(jìn)行萃取，對(duì)萃取次數(shù)進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，氯仿對(duì)PMP的萃取率較高，3次萃取后即可去掉99.0%的PMP。而對(duì)單糖衍生物的萃取影響不大，3次萃取后單糖衍生物的損失為3.50%。因此，確定萃取次數(shù)為3次。

3.7 檢測(cè)線性及檢出限

將5種單糖配制成一系列不同濃度的混合標(biāo)樣，分別按“2.2”衍生化，并在“2.4”所述條件下進(jìn)樣檢測(cè)，以測(cè)得的各種糖的峰面積對(duì)相應(yīng)濃度作工作曲線，結(jié)果見表1。

3.8 銀耳多糖樣品的單糖組成分析和方法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

在單糖組成分析中由于只需求得單糖間的摩爾比，并不需要知道各單糖的具體量。所以，在樣品的分析中采用面積歸一法計(jì)算。由于甘露糖在TPP2水解液中的濃度較大，為滿足線性范圍，采用稀釋10倍后進(jìn)行單獨(dú)測(cè)定。根據(jù)分析和計(jì)算方法，求得TPP2中各單糖的組成摩爾比為甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖=77∶10∶3∶1∶15。甘露糖的 RSD （n=6）為2.13%；鼠李糖的RSD（n=6）為0.56%；葡萄糖的RSD（n=6）為 1.08%；半乳糖的 RSD（n=6）為 3.81%；木糖的 RSD（n=6）為 0.72%。

表1 銀耳多糖TPP2的組成測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)束語

對(duì)PMP衍生化方法進(jìn)行了較系統(tǒng)深入的優(yōu)化研究，考察了PMP與NaOH的用量、反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響，確定了中和時(shí)反應(yīng)體系的溫度和鹽酸用量。研究表明，反應(yīng)體系在冷水浴（12℃）中冷卻10min后，中和至微酸（pH 5.64）再進(jìn)行萃取等操作，才會(huì)獲得較好的色譜分離效果。建立了18%乙腈-磷酸鹽緩沖液（20mmol·L-1、pH 6.72）為流動(dòng)相等度 HPLC分析5種單糖的定性定量方法。利用該方法對(duì)TPP2的單糖組成進(jìn)行了測(cè)定，求得TPP2中甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖的摩爾比為 77∶10∶3∶1∶15。與文獻(xiàn)[2]比較，該方法的檢測(cè)靈敏度大大提高，并彌補(bǔ)了不能分離檢測(cè)葡萄糖和半乳糖的不足，可望推廣用于其他多糖的單糖組成研究。

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Analysis of monosaccharide com positions in tremella polysaccharides by pre-column derivatization high performance liquid chromatography

YAN Jun1，2，HOU Xian-deng1，XU Kai-lai1
（1.College of Chemistry，Sichuan University，Chengdu 610064，China；2.Laboratory for Chemistry of Traditional Chinese Medicine，Chengdu University，Chengdu 610106，China）

A method of PMP pre-column derivatization high performance liquid chromatographic was established for analysis of five kind of monosaccharide.The optimum conditions of derivatization were determined by studying the quantity of PMP and sodium hydroxide，reaction time，reaction temperature and hydrochloric acid consumption during neutralization.Under the optimum mobile phase which was 18%acetonitrile-phosphate buffer（20mmol·L-1，pH 6.72），PMP derivatives can be separated successfully.This method was applied to monosaccharide compositions analysis of tremella polysaccharide（TPP2）.

monosaccharide；polysaccharide；HPLC；PMP

S567.3+4；TS247

A

1674-5124（2011）01-0044-03

2010-04-20；

2010-08-03

四川省中醫(yī)藥管理局科技專項(xiàng)資助項(xiàng)目（2008-01）

顏 軍（1971-），男，四川成都市人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事生物活性成分的分離與檢測(cè)工作。