張 軍,曹 茜,李新生,陳 敏,王 軍＊

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京市海淀區(qū)清華東路17號(hào) 100083

2.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心煙草行業(yè)卷煙煙氣重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海市長(zhǎng)陽(yáng)路717號(hào) 200082

3.上海煙草集團(tuán)太倉(cāng)海煙再造煙葉有限公司,江蘇太倉(cāng)港口開(kāi)發(fā)區(qū)東方東路19號(hào) 215433

再造煙葉是利用卷煙過(guò)程中廢棄的煙梗、煙末和煙片等作為原料制成接近煙葉的薄片,從而再用于卷煙生產(chǎn)[1-2]。果膠是一種親水性植物膠,是以半乳糖醛酸為主的復(fù)合多糖類(lèi)物質(zhì),存在于高等植物的葉、根、莖的細(xì)胞壁內(nèi),與細(xì)胞彼此粘合在一起[3-4]。果膠約占煙草質(zhì)量的6%～12%,煙梗果膠分子在半乳糖醛酸主鏈中連接著2-吡喃型鼠李糖基,約22%的半乳糖醛酸甲基化[5]。果膠熱解產(chǎn)生甲醇[6-7],對(duì)煙氣吸味不利。另外,果膠發(fā)酵生成多達(dá)1.0%～1.5%的乙酸,乙酸產(chǎn)生辛辣和刺激味,也會(huì)影響煙氣的吸味。目前生產(chǎn)中常用熱水浸梗、洗梗的方法去除果膠,但由于果膠常與鈣等離子結(jié)合使其在水中的溶解度很低,致使該方法去除果膠的效果不好。而煙梗中果膠的研究多集中在采用生物技術(shù)的方法水解煙梗中的果膠[8-9],以及將煙梗作為廢棄物粉碎后提取其中的果膠[10-12]。而在不破壞煙梗物理狀態(tài)和影響在后續(xù)再造煙葉生產(chǎn)中應(yīng)用的前提下,利用簡(jiǎn)便的化學(xué)、物理方法去除其中果膠的研究卻很少見(jiàn)報(bào)道。因此,作者進(jìn)行了此項(xiàng)研究。

研究煙梗中果膠的去除方法,首先需要選擇一種能夠簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確測(cè)定煙梗中果膠含量的方法。果膠的測(cè)定方法主要有重量法、硫酸咔唑法、3,5-二硝基水楊酸顯色法[13]、3,5-二甲苯酚分光光度法[14]、高效液相色譜法[15]、酶解-流動(dòng)分析法[16]等。本研究中采用改進(jìn)的硫酸咔唑法測(cè)定煙梗中果膠的含量,該方法能有效消除煙梗中糖的干擾,簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地測(cè)定在浸提工藝前后煙梗中果膠的含量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

煙梗(湖南,短梗),α-萘酚、EDTA、磷酸氫二銨、乙醇、磷酸氫二銨(AR,北京化工公司),六偏聚磷酸鈉(AR,汕頭市西朧化工廠),草酸銨(AR,天津市津科精細(xì)化工廠),硫酸(GR,北京化工廠),咔唑(GR,Sigm a-A ld rich公司),半乳糖醛酸鈉(GR,ACROS ORGAN ICS公司),果膠標(biāo)準(zhǔn)品(GR,Sigm a-A ld rich公司)。

THZ-82恒溫振蕩器(國(guó)華企業(yè)有限公司),恒溫水浴鍋(北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司),722-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上?，F(xiàn)科儀器有限公司),TD I-5A離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 測(cè)定前處理

果膠水解成半乳糖醛酸,半乳糖醛酸在濃硫酸介質(zhì)中與咔唑反應(yīng)能形成穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合物,在525 nm下有最大吸收,通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定出半乳糖醛酸的含量,即可換算出果膠的含量。水解液中的糖類(lèi)化合物也與咔唑反應(yīng),干擾了測(cè)定結(jié)果,因此在測(cè)定之前用濃度為63%的乙醇溶液在85℃的水浴中洗滌10 min,除去果膠中糖類(lèi)化合物,消除對(duì)測(cè)定果膠的干擾。

1.2.2 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制濃度為0.04,0.06,0.08,0.10,0.12 m g/mL的一系列半乳糖醛酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液,各取1 mL,加入0.5 mL的0.1%咔唑無(wú)水乙醇溶液,產(chǎn)生白色沉淀,搖勻后加入5 mL的濃硫酸,立即放入85℃的水浴中5 min,隨后冷卻15 min,于525 nm下測(cè)定吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 煙梗中果膠的提取與測(cè)定

提取:10 g煙?！犹崛≈鷦┤芤骸鷵u床中浸提→熱濾(70℃)→再提取一次→合并提取液→取5 mL濾液→50 mL離心管→加95%熱乙醇20 mL→水浴(85℃、10 min)→離心3000 r/min、15 min→沉淀→加63%熱乙醇洗滌(85℃、10 min)→離心(3000 r/min、15 min)棄上清液→重復(fù)3次去糖,用穆立虛反應(yīng)法檢驗(yàn)[17]→得果膠沉淀。

測(cè)定:溶解沉淀至100 mL容量瓶后用硫酸咔唑法[18]測(cè)定。

1.2.4 煙梗中總果膠含量的測(cè)定

按1.2.3的步驟,以H3PO4+NaH2PO4配制成pH為2.0的150 mL酸性溶液在90℃水浴搖床中浸提1 h,趁熱過(guò)濾,得1次濾液。再用草酸銨溶液150 mL,在90℃水浴搖床中浸提過(guò)濾后的煙梗1.5 h,重復(fù)1次,分別得2次和3次濾液。測(cè)定3次提取液中的果膠濃度,3次之和為煙梗中的總果膠含量。

1.2.5 果膠去除率計(jì)算

果膠去除率(%)=提取出的果膠總量/煙梗中總果膠的含量

2 結(jié)果與討論

2.1 煙梗果膠的測(cè)定

2.1.1 測(cè)定方法的驗(yàn)證

按1.2.2步驟,配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,用半乳糖醛酸鈉作外標(biāo),得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為:y=113.79x-0.9432、相關(guān)系數(shù)為:0.9980,可以看出方法線性良好。

按1.2.3步驟,在草酸銨濃度為1.20%,溫度為70℃,浸提時(shí)間為30 min,液料比為10∶1,pH為6的條件下浸提,測(cè)定吸光度值,計(jì)算果膠含量。平行浸提測(cè)定5個(gè)樣品,計(jì)算RSD值為:1.66%,RSD值小于5%,滿足樣品分析要求。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定回收率。稱(chēng)取兩個(gè)10.000 g煙梗樣品,分別加入果膠標(biāo)準(zhǔn)品0.3 g,在草酸銨濃度為1.20%,溫度為70℃,浸提時(shí)間為30 min,液料比為10∶1,pH為6的條件下分別浸提,測(cè)定其吸光度值。計(jì)算果膠含量計(jì)算出浸提方法的回收率為94.64%,表明該方法適用于煙梗中果膠去除率分析研究。

2.1.2 煙梗中總果膠含量的測(cè)定

煙梗中總果膠含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1,由圖1可知,3次浸提出果膠量分別為69.8,680,77.6 m g。第一次浸提出的果膠較少,是因?yàn)榻嵋褐械乃嵘形茨軐煿Ｖ械睦w維素、半纖維素、木質(zhì)素破壞而使果膠暴露出來(lái),從而浸提率不高。第三次浸提出的果膠只占3次之和的9%,說(shuō)明前兩次已經(jīng)浸提出煙梗中的絕大部分果膠,因此可認(rèn)為3次之和等于煙梗中的總果膠含量。煙梗中總果膠約占重量的8.27%。

2.2 果膠提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 提取助劑的選擇

由于煙草果膠的水溶性較差,因此考慮對(duì)果膠可起絡(luò)合、沉淀等作用的助劑,選取水、EDTA溶液、六偏聚磷酸鈉溶液、磷酸氫二銨溶液、草酸銨溶液分別進(jìn)行浸提后,對(duì)比分析它們的果膠去除效果。如圖2所示,水和EDTA溶液對(duì)煙梗果膠的去除率小于5%,六偏聚磷酸鈉溶液、磷酸氫二銨溶液、草酸銨溶液對(duì)果膠的去除率隨溶液濃度的增加而升高,其中草酸銨溶液的去除效果最好。

2.2.2 單因素的影響

草酸銨浸提去除煙梗果膠,影響果膠去除率的因素主要包括濃度、溫度、時(shí)間、液料比和pH,做單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可知,濃度在0.3%至0.9%區(qū)間內(nèi)對(duì)果膠去除率的影響較大;溫度在90℃時(shí)去除率最高,但在70℃至80℃區(qū)間果膠去除率隨溫度升高最快;去除率隨時(shí)間的增加而變大,45～60 min區(qū)間增加最快,60～75 min區(qū)間增加緩慢;隨著液料比的增大,果膠去除率先以較快的速率增加,然后變緩慢,液料比達(dá)到20∶1時(shí),果膠去除率基本保持不變;pH值對(duì)煙梗果膠去除率的影響較小,由于煙梗提取液呈弱酸性,在浸提工藝中通常不調(diào)節(jié)pH,因此在后續(xù)響應(yīng)曲面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中不考慮此因素。

圖3 濃度、溫度、時(shí)間、料液比、pH對(duì)果膠去除效果的影響

2.2.3 響應(yīng)曲面優(yōu)化(RS M)

從單因素實(shí)驗(yàn)中選出濃度、溫度、時(shí)間和料液4個(gè)因素,每個(gè)因素選取3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)曲面分析,結(jié)果見(jiàn)表1。表中相對(duì)果膠去除率Z是[Z=X/Y:表中的每一因素組的果膠去除率減去前一個(gè)因素組的果膠去除率,如編號(hào)1∶0.90 70 60 20的果膠去除率減去編號(hào)1＊∶0.60 60 45 15的果膠去除率,所得值記為X;用各項(xiàng)因素中能量因素的乘積除以各因素的基礎(chǔ)能量的乘積,如編號(hào)1∶0.90 70 60 20中為0.90×70×60×20/(0.60×60×30×10),所得記為Y]表征以單位耗能去除果膠的相對(duì)比率。相對(duì)果膠去除率是在考慮到能耗等經(jīng)濟(jì)因素的基礎(chǔ)上建立的,而不是單純追求指標(biāo)最大化,對(duì)于如何在單位能耗的條件下優(yōu)化生產(chǎn)工藝,提高經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。

根據(jù)表1的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),利用Design expert7.1軟件計(jì)算出四因素與相對(duì)果膠去除率之間的回歸關(guān)系式為:

相對(duì)果膠去除率=5.87-2.93A+0.98B-0.80C-3.00D-1.50AB-1.04AC+0.80AD-0.12BC+0.42BD+0.71CD+1.20A2+0.58B2+0.77C2+1.25D2

回歸曲線見(jiàn)圖4所示。

相對(duì)果膠去除率的回歸曲線后做方差分析,結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)表1與表2的結(jié)果,在控制其中兩因素的值不變的前提下,改變另外兩個(gè)因素的值,作出這兩變量之間的變化關(guān)系圖,各因素的交互作用圖見(jiàn)圖5。分析表2與圖5可知,各因素對(duì)果膠去除率影響的顯著性依次為:濃度A、液料比D>溫度B>時(shí)間C(其中時(shí)間是非顯著性因素);濃度與溫度交互作用接近顯著,溫度與時(shí)間交互作用不顯著,濃度與液料比交互作用不顯著,溫度與時(shí)間交互作用不顯著,溫度與液料比交互作用不顯著,時(shí)間與液料比交互作用不顯著。

在Design expert7.1軟件中設(shè)定相對(duì)果膠去除率在0～15%之間,根據(jù)響應(yīng)面數(shù)據(jù)得出此范圍內(nèi)的可信實(shí)驗(yàn)方案見(jiàn)表3。從表中選取可信度計(jì)算值最高的1號(hào)實(shí)驗(yàn)方案,果膠提取去除條件為:草酸銨濃度1.2%,反應(yīng)溫度60℃,浸提時(shí)間30 min,液料比10∶1。在此條件下,做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得果膠去除率為30.18%,與軟件計(jì)算提供的方案結(jié)果相差2.4%,說(shuō)明該方案條件可信、有效。

表1 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 果膠去除率的回歸曲線

表2 方差分析數(shù)據(jù)

3 結(jié)論

建立了在去糖基礎(chǔ)上的硫酸咔唑果膠分析方法,并以該方法為基礎(chǔ),通過(guò)二次作差響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)分析方法,對(duì)煙梗果膠浸提工藝進(jìn)行優(yōu)化,最佳工藝條件為:1.2%草酸銨溶液,液料比為10∶1,提取溫度為60℃,浸提時(shí)間為30 min。采用此工藝條件,果膠去除率可達(dá)到30.18%,用該方法處理后的煙梗應(yīng)用于再造煙葉制造,其中果膠含量降低。

表3 可信實(shí)驗(yàn)方案數(shù)據(jù)表

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