劉小玲，周 鴻，于 暉，譚洪濤

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330029)

環(huán)境空氣中尼古丁的高效液相色譜測定方法

劉小玲，周 鴻，于 暉，譚洪濤

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330029)

目的建立高效液相色譜(HPLC)測定環(huán)境空氣中尼古丁的方法。方法樣品通過反相C18柱(150×4.6mm)分離，采用磷酸二氫鉀-乙腈溶液為流動相(流速為1ml/min，采用等度洗脫)，通過紫外檢測器檢測(波長為260nm)。結(jié)果該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為 0.99993，工作曲線的相關(guān)系數(shù)為 0.9995，檢出限為 4.03×10-3μg/ml，測定下限為 3.12×10-2μg/ml，對低、中、高 3濃度尼古丁加標(biāo)回收率為87.4%、88.5%、90.8%，對低、中、高3濃度尼古丁測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.88%、0.52%、1.1%，對低、中、高3濃度尼古丁的解吸率測定分別為92.3%、94.3%、94.6%，以及采樣器中樣品穩(wěn)定性實驗，表明11d內(nèi)樣品均穩(wěn)定。結(jié)論該方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，操作簡便，儀器易普及。

高效液相色譜；環(huán)境空氣中尼古??；檢測

目前，國內(nèi)外尼古丁的測定方法[1-3]有很多種，例如可以采用 LC-MS、LC-MS-MS[4]、GC-MS[5]的方法，但由于這些方法中儀器較昂貴，儀器保有量很低，無法在基層單位推廣。由于用高效液相色譜檢測尼古丁的方法具有靈敏度高，重現(xiàn)性好，且儀器易普及的特點，適用于實驗室推廣使用。因為本方法不僅可以監(jiān)測環(huán)境空氣中尼古丁的濃度，還可以測定人體生物樣品如尿液[6]、唾液[7]和頭發(fā)[8]中的尼古丁含量，從而可以比較準(zhǔn)確地評價人群的暴露水平，為制訂科學(xué)的控?zé)煷胧┘霸u價控?zé)熜Ч峁┘夹g(shù)支持。

材料與方法

1 方法原理 環(huán)境中氣態(tài)尼古丁采用被動式采樣器采樣，采樣后將4%NaHSO4-5%甘油溶液浸漬的玻璃纖維濾膜經(jīng)氫氧化鈉洗脫和正庚烷萃取，在萃取液中加鹽酸混勻，用氮吹儀吹至近干，用1ml流動相定容。使用C18反相色譜柱分離，紫外檢測器檢測，檢測波長為260nm，以保留時間定性，以峰面積定量。

2 實驗儀器、材料和試劑

2.1 實驗儀器和材料 LC-20A型高效液相色譜儀，快速混勻器，超聲波清洗器，TTL-DCⅡ型氮吹儀，玻璃纖維濾膜(d=42mm)，被動式采樣殼體(由中疾控提供)，10μl和 50μl微型注射器，1.5ml樣品瓶

2.3 實驗試劑 尼古丁(標(biāo)準(zhǔn)品)，磷酸二氫鉀(分析純)，磷酸(分析純)，鹽酸(分析純)，乙腈(色譜純)，庚烷磺酸鈉(色譜純)，正庚烷(色譜純)，甘油(分析純)，氫氧化鈉(分析純)。

3 樣品采集

3.1 尼古丁吸收液的配置 準(zhǔn)確稱量20.0g NaHSO4和25.0g甘油，用純水定容于500ml，配制成4%NaHSO4-5%甘油的尼古丁吸收液。

3.2 濾膜制備 選擇合格濾膜，對光檢查無針孔或折縫；將玻璃纖維濾膜在馬弗爐中450℃烘烤2h，放入干燥器中冷卻至室溫；從干燥器中取出玻璃纖維濾膜，用尼古丁吸收液浸漬0.5h后，取出置于干燥器中晾干備用。

3.3 采樣器安裝 被動式采樣器由殼體、擋風(fēng)層和吸收層組成。殼體包括前蓋、壓環(huán)、托板和底座，擋風(fēng)層為核孔濾膜和滌綸紗網(wǎng)，吸收層為浸漬尼古丁吸收液的玻璃纖維濾膜。安裝好采樣器后，放入鋁箔袋中，封口。

4 實驗分析步驟

4.1 流動相的制備 準(zhǔn)確稱取1.09g磷酸二氫鉀，用超純水溶解至接近于1L，用磷酸調(diào)節(jié)pH值為3，定容至1L，準(zhǔn)確加入0.0082g庚烷磺酸鈉，混勻，通過0.45μm過濾膜過濾，制得的磷酸二氫鉀溶液與乙腈比例為9∶1混勻。

4.2 色譜條件 色譜柱為Vp-C18柱 (150×4.6mm)，柱溫為 25℃，SPD檢測器，檢測波長為260nm，流動相流速為1ml/min。

4.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 準(zhǔn)確稱取10.1mg(99%的尼古丁)于10ml容量瓶中，加入流動相定容，超聲3min，配成 1.0μg/μl的尼古丁(Ⅰ)液，取(Ⅰ)液 1ml于 10ml容量瓶中，用流動相定容，得0.1μg/μl的尼古丁(Ⅱ)液。

4.4 尼古丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別移取尼古丁(Ⅱ) 液 5μl、10μl準(zhǔn)確加入 1ml流動相， 混勻，得0.5μg/ml、1μg/ml。 又分別移取尼古丁 (Ⅰ) 液 2μl、4μl、 8μl、16μl準(zhǔn)確加入 1ml流動相，混勻，得 2μg/ml、 4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml標(biāo)準(zhǔn)系列，得到尼古丁的標(biāo)準(zhǔn)系列分別進樣5μl進行分析，各點進樣3次，各點對應(yīng)峰面積取平均值，以標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo),繪制峰面積和濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4.5 尼古丁工作曲線的制備 分別移取尼古丁(Ⅱ)液 5μl、10μl，移取尼古丁(Ⅰ)液 2μl、 4μl、 8μl、16μl置于制備好的玻璃纖維濾膜上，分別放于10ml比色管中，各加入5.0ml1.5mol/L的NaOH和準(zhǔn)確加入2.0ml正庚烷充分混勻后在恒溫65℃超聲30min，取出于漩渦混勻器上，混勻3min，取正庚烷層(1.8ml)，加 10μl鹽酸，65℃超聲混勻 3min，漩渦2min，氮吹近干，用1ml流動相定容，65℃水浴超聲3min漩渦2min徹底解析出尼古丁。分別進樣5μl進行分析，各點進樣3次，各點對應(yīng)峰面積取平均值，以標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制峰面積和濃度的工作曲線。

4.6 樣品處理 將樣品取回后，取出內(nèi)裝的玻璃纖維濾膜，置于10.0ml比色管中，各加入5.0ml 1.5mol/LNaOH和準(zhǔn)確加入2.0ml正庚烷充分混勻后在恒溫65℃超聲30min，取出于漩渦混勻器上，混勻3min，取正庚烷層(1.8ml)，加 10μl鹽酸 65℃超聲混勻3min，漩渦2min，氮吹近干，用1ml流動相定容，65℃水浴超聲3min漩渦2min徹底解析出尼古丁。進樣5μl測定，根據(jù)尼古丁工作曲線的回歸方程計算膜上的尼古丁含量。采樣放置某辦公室4d，取回采樣器測定樣品結(jié)果。

結(jié) 果

1 尼古丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

做得的曲線線性方程為y=0.0001932x-0.03952，線性相關(guān)系數(shù) γ=0.99993。

2 尼古丁工作曲線

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

做得的曲線線性方程為y=6.36×10-4x－0.1492，線性相關(guān)系數(shù)γ=0.9995

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 檢出限及測定下限

連續(xù)測定10次空白濃度的溶液，計算響應(yīng)值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以3倍標(biāo)準(zhǔn)差所對應(yīng)的待測物濃度為檢出限，以10倍標(biāo)準(zhǔn)差所對應(yīng)的待測物濃度為測定下限。10次測定結(jié)果見表3。

平均值=19.08， 標(biāo)準(zhǔn)偏差 S=20.4，3S=61.2 10S=204

根據(jù)回歸方程f(x)=0.000190111x－0.00760803

檢出限：f(x)=0.000190111×61.2－0.00760803＝4.03×10-3μg/ml

檢出下限：f(x)=0.000190111×204－0.00760803＝3.12×10-2μg/ml

表2 工作曲線

圖2 工作曲線

表3 檢出限及測定下限

4 精密度測試

移取尼古丁(Ⅱ)液 10μl、尼古丁(Ⅰ)液 4μl、8μl準(zhǔn)確加入1ml流動相， 混勻， 得1μg/ml、 4μg/ml、8μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進樣5μl進行測定，每個濃度測定6次，結(jié)果如表4。

表4 精密度測試

5 準(zhǔn)確度的測試

在現(xiàn)場樣品中，加入高、中、低3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液 (1μl即 1μg/ml，4μg/ml，8μg/ml) 按 4.6 樣品處理，然后測定樣品溶液和加標(biāo)溶液，各測定3次，由平均值計算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表5。

6 樣品穩(wěn)定性實驗

配制濃度為1μg/ml和4μg/ml兩標(biāo)準(zhǔn)溶液，分兩組分別注入12個濾膜中，采樣器密封后，分別在當(dāng)天、第 3d、第 5d、第 7d、第 9d、第 11d 測定，每天測定3個樣品，按下列公式計算下降率，以下降率≤10%的天數(shù)為穩(wěn)定時間，由表6和表7可見，本方法樣品的穩(wěn)定時間至少為11d。

表5 準(zhǔn)確度測試

表6 濃度為1μg/ml穩(wěn)定性實驗

表7 濃度為4μg/ml穩(wěn)定性實驗

7 解吸效率測試實驗

取9個10ml試管，分別向每3個試管中加入濃度為 0.8μg/ml、4μg/ml、7.2μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液， 又取 9個 10ml試管， 分別將 3 個加有 0.8μg/ml、4μg/ml、7.2μg/ml濃度尼古丁的濾膜放入，然后分別于18支試管中各加入5ml1.5mol/LNaOH，2.0ml正庚烷65℃超聲30min，漩渦混勻3min，取出正庚烷層(1.8ml)，加入10μl鹽酸，氮吹，加1ml流動相定容，65℃水浴超聲3min漩渦2min徹底解析出尼古丁。過0.45μm濾膜，進樣5μl，同時做試劑空白和濾膜空白。結(jié)果見表 8、表 9、表 10。

討 論

該方法操作簡便，靈敏度、精密度及準(zhǔn)確度好，但由于尼古丁與水有很好的互溶性，所以用1.5mol/L NaOH水溶液能很好的洗脫濾膜上的尼古丁，但是用正庚烷萃取NaOH水溶液中的尼古丁時，雖然提高溫度(65℃)可以提高萃取率，但仍然不能完全萃取(只能達到約85～90%的回收率)。測定時可做工作曲線消除損失，取出正庚烷層時加入鹽酸10μl一定要讓鹽酸與尼古丁充分反應(yīng)生成尼古丁鹽，氮吹后加入流動相要讓尼古丁鹽充分解析出尼古丁，這樣可以得到很好的回收率。

表8 解吸率測試實驗(加入濃度0.8μg/ml)

表9 解吸率測試實驗(加入濃度4.0μg/ml)

表10 解吸率測試實驗(加入濃度7.2μg/ml)

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Determination of nicotine in the ambient air by high performance liquid chromatography

LIU Xiaoling,ZHOU Hong,YU Hui,et al.Center of Disease Control and Prevention of Jiangxi province,Nanchang 330029,China

ObjectiveTo establish high performance liquid chromatographic(HPLC)assay for the determination of nicotine in the air.MethodsThe sample was separated by reversed-phase C18 column(150×4.6mm)using the potassium dihydrogen phosphate-acetonitrile solution as mobile phase (with flow velocity of 1ml/min,used isocratic elution),and detected by ultraviolet array detector at 260nm.ResultsThe correlation coefficient of the standard curve was 0.99993,and the working curve was 0.9995.Limit of detection was 4.03×10-3μg/ml and limit of quantification was 3.12×10-2μg/ml for nicotine.For the spiked samples of the low,medium and high concentration of nicotine,the recoveries were 87.4%,88.5%and 90.8%,the relative standard deviations were 0.88%,0.52%and 1.1%and the desorption rates were 92.3%,94.3%and 94.6%,respectively.Nicotine test indicated stable in 11 days with determining the sample stability.Conclusions This method is of high sensitivity,better RSD and simple operation,and the instrument can be easily popularized.

High-performance liquid chromatographic;Nicotine in air;Detection

R122.1+1

A

1674-1129(2011)01-0015-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2010.01.006

國家科技支撐計劃，課題編號：2008AI56B07

劉小玲，女，1961年11月出生，江西玉山縣人，副主任技師，畢業(yè)于江西大學(xué)化學(xué)系，從事衛(wèi)生檢驗，主攻理化檢驗。