吳定偉 王麗婭 陳小龍 萬建峰

（1浙江仙琚制藥股份有限公司，浙江 仙居 317300；2浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014；3浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用工程系，浙江 杭州 310018）

甾體類化合物都具有環(huán)戊烷并多氫菲結(jié)構(gòu)，常見的如甾體激素黃體酮、睪酮，以及內(nèi)源性物質(zhì)膽固醇［1］。人們對甾體化合物的研究已經(jīng)開展數(shù)十年，發(fā)現(xiàn)其對糖代謝、脂肪代謝、蛋白質(zhì)合成、礦物質(zhì)合成以及性功能和神經(jīng)調(diào)節(jié)等都具有重要的生理功能，目前已經(jīng)有幾十種上市的甾體藥物，其治療領(lǐng)域包括抗炎、抗過敏、降壓、避孕、增強(qiáng)抵抗力和抗腫瘤等［2-3］。

在上市的甾體藥物中，糖皮質(zhì)激素類藥物臨床應(yīng)用最為廣泛，是最為重要的甾體類藥物。它們具有強(qiáng)大的抗炎活性，適用于各種炎癥，過敏性疾病和休克等危重疾病，其結(jié)構(gòu)中11-β羥基是化合物產(chǎn)生抗炎活性的關(guān)鍵藥效片段。由于甾體結(jié)構(gòu)的特點，采用化學(xué)方法進(jìn)行11-β羥基化反應(yīng)費時、費力，且很難保證11位羥基的β構(gòu)型。而采用微生物轉(zhuǎn)化法卻能選擇性的在甾體的11位引入羥基，迄今為止，已經(jīng)相繼發(fā)現(xiàn)具有甾體羥化作用的細(xì)菌、放線菌、真菌、霉菌等。其中國內(nèi)大多數(shù)甾體生產(chǎn)企業(yè)采用藍(lán)色犁頭霉進(jìn)行11-羥化反應(yīng)，但是仍存在選擇性較差，易產(chǎn)生11-α羥化產(chǎn)物以及其他位置羥化產(chǎn)物，收率在45％左右［4-6］。另外也有文獻(xiàn)報道采用新月彎孢霉、黑根霉等菌種進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，收率也僅有一定幅度的提高，達(dá)到50％左右。因此，有必要進(jìn)一步對多個菌種進(jìn)行篩選和培育，力求獲得高效11β-羥基化沃氏氧化物的微生物菌株。本論文采用紫外誘變、低能氮離子注入誘變和鈷-60誘變這3種國內(nèi)外常用方法對菌種施行多樣化的選育操作［7-10］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

雅致小克銀漢霉Cunningnamella elegans（編號40250），購自北京微生物菌種保藏中心，其他菌種均來自浙江仙琚制藥股份有限公司。

1.1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

葡萄糖3％，玉米漿3.5％，（NH4）2SO40.5％，酵母粉0.25％，玉米油0.1％。

1.1.3 主要設(shè)備和試劑

高效液相色譜儀，日本島津公司生產(chǎn)的LC-10A。鈷-60誘變在浙江省農(nóng)科院進(jìn)行。低能氮離子注入誘變在浙江工業(yè)大學(xué)進(jìn)行。沃氏氧化物、11β-羥基-16α，17α-環(huán)氧孕酮和11α-羥基-16α，17α-環(huán)氧孕酮霉菌氧化物由浙江仙琚制藥股份有限公司提供。高效液相色譜用甲醇和乙腈為色譜級，其他試劑均為分析純。

1.2 分析方法

1.2.1 菌懸液的pH測定及菌體重量測定

將矯正好的pH電極放入被測菌懸液中，等讀數(shù)穩(wěn)定后讀取顯示器上的數(shù)字即為該菌液的pH值。將搖床培養(yǎng)48h后的菌懸液抽濾，稱量菌體重量，記為W濕，然后將其放入烘箱里烘至恒重，取出稱量記為W干。

1.2.2 轉(zhuǎn)化底物和產(chǎn)物檢測

采用HPLC法分析轉(zhuǎn)化底物和產(chǎn)物。色譜條件：C18反相色譜柱，流動相：乙腈：水=60：40，檢測波長：245nm，流速：1.5mL/min，進(jìn)樣量：10μL。

1.3 實驗方法

1.3.1 土豆培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖3％、玉米漿3％、（NH4）2SO40.5％、酵母粉0.25％，F(xiàn)eSO40.01％和玉米油0.1％，培養(yǎng)基經(jīng)121℃滅菌20min，備用。

1.3.2 菌種活化

菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面，在28℃下培養(yǎng)3d。

1.3.3 底物投料

稱取6g沃氏氧化物，3.6g β-環(huán)糊精及少量吐溫80，溶于60mL的水中，在加熱條件下充分?jǐn)嚢?。用移液管吸?mL的底物溶液加入已經(jīng)培養(yǎng)22h的搖瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)48h進(jìn)行羥化反應(yīng)。

1.3.4 發(fā)酵液的預(yù)處理將發(fā)酵轉(zhuǎn)化后得到的發(fā)酵液混合物先測其pH值，然后過濾去除上清液，取0.1g濕菌絲體，其余稱量濕重W濕，然后放入烘箱里80℃下干燥并稱其重W干。在0.1g濕菌絲體中用5mL的乙酸乙酯在密封條件下萃取30min。離心后取萃取液1mL于EP管中，用吹風(fēng)機(jī)吹干，再加入1mL的分析純甲醇，震蕩溶解5min，冰箱保存待檢測。

1.3.5 誘變方法

1.3.5.1 紫外誘變

將200μL菌懸液（或加入底物）接入培養(yǎng)皿，啟動磁力攪拌器，使用20W功率紫外燈管，照射距離為15cm。實驗誘變時間分別設(shè)定為30s和60s，處理過程在暗室操作。處理完畢后，將盛菌懸液的器皿用密封紙盒包起來培養(yǎng)，最后放入25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3d，期間觀察菌體長勢，然后再進(jìn)行分離篩選。

1.3.5.2 低能氮離子注入誘變

吸取200μL的孢子液涂到無菌玻璃平皿上，同時用一個平皿進(jìn)行真空處理對照，另一個平皿做外環(huán)境對照。用涂棒涂勻，放在無菌操作臺上吹干后，再置于離子束裝置靶室，分別用20keV的氮離子（N+）照射處理，劑量為90s、120s、150s（離子束單位為×2.6×1013ions/cm2·s），選取大劑量240s和300s做參照。

1.3.5.3 鈷-60誘變

選定5個照射的劑量：1000，1200，1400，1600和1800keV進(jìn)行Co-60誘變，將誘變的菌懸液稀釋成5個梯度，稀釋后的菌懸液注入25個培養(yǎng)皿中，使用土豆培養(yǎng)基，最后放入恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

2 結(jié)果與討論

2.1不同微生物菌株轉(zhuǎn)化能力的比較

表1 不同微生物菌株轉(zhuǎn)化能力的比較

從表1中可以發(fā)現(xiàn)S 418黑根霉發(fā)酵產(chǎn)物中不含有11β-沃氏物，而11α-沃氏物的含量很高，結(jié)果與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)相符，驗證了S 418黑根霉能提高產(chǎn)物11α位點的轉(zhuǎn)化率，11β位點基本不發(fā)生反應(yīng)。新月彎孢霉X1和X2的發(fā)酵產(chǎn)物中都不含有11β-沃氏物，這與國外的研究成果不相符，通過觀察活化的菌種發(fā)現(xiàn)其形態(tài)和顏色與文獻(xiàn)中的描述不相同（重復(fù)活化情況仍相同），懷疑菌種可能已經(jīng)退化或者染菌，后期實驗放棄使用。藍(lán)色犁頭霉D1、D2、D5的底物轉(zhuǎn)化率偏低，同時產(chǎn)物中不含有11β-沃氏物，藍(lán)色犁頭霉和銀漢霉的發(fā)酵產(chǎn)物與其他5種菌相比含11β-沃氏物但含量偏低。

2.2 紫外誘變育種

表2 紫外誘變藍(lán)色犁頭霉

表2顯示轉(zhuǎn)化率沒有明顯的提高，致死率基本都達(dá)到了90％以上，可能是照射時間不夠，只有2個菌株的產(chǎn)率高于初始數(shù)據(jù)，正變率為16.7％，產(chǎn)量提升僅為15％。

表3 紫外誘變銀漢霉

而表3中顯示轉(zhuǎn)化率有一定波動幅度，一些產(chǎn)率提高了20％，在大劑量240s均發(fā)現(xiàn)產(chǎn)率出現(xiàn)了下降，采用相同方式再進(jìn)行一次操作得出類似的結(jié)果。表明在大劑量誘變的情況下，正突變頻率并沒有增加，正變率僅為8.7％，同時產(chǎn)率浮動較大。通過多次的誘變發(fā)現(xiàn)，銀漢霉的誘變菌株相比藍(lán)色犁頭霉誘變株產(chǎn)率提升較大，但是11β-沃氏物含量仍然停留在5％左右，與文獻(xiàn)中40％～45％的轉(zhuǎn)化率有很大差距。如果進(jìn)一步增加照射時間有又會對菌種造成損害，同時也無法保證產(chǎn)率能獲得質(zhì)的提升。

2.3 低能氮離子注入誘變育種

從表4可看出，在20keV的能量、90s～150s的劑量范圍內(nèi)，銀漢霉的致死率并沒有一直隨著照射劑量的增加而上升，而是隨著氮離子（N+）照射劑量的加大先增大后降低，同期實驗獲得的結(jié)果相同，這是因為用離子束照射處理微生物可能產(chǎn)生先降后升再降的"馬鞍型"存活曲線。從表中可以看出，菌種誘變結(jié)果大部分為正常范圍或正變，產(chǎn)率提高了20％～40％，正變率達(dá)15.6％。通過加大劑量又會導(dǎo)致菌體無法生長，選擇在低劑量的范圍比較合適，在20keV的能量下，劑量90s和120s時的正變率最高，最高含量達(dá)到5.8％。

表4 低能氮離子注入誘變銀漢霉

2.4 鈷-60誘變育種

表5 鈷-60誘變銀漢霉

從表5中看出，菌種誘變結(jié)果大部分為正常范圍或負(fù)變，正變率依舊為0。隨著照射劑量的增加產(chǎn)率并沒有明顯的變化，同時獲得的單菌落數(shù)量偏少?？紤]Co-60誘變是一種破壞性較強(qiáng)的誘變過程，在照射時對銀漢霉菌體造成了不可恢復(fù)的影響。

4 結(jié)論

以保藏菌株土曲霉藍(lán)色梨頭霉（Absidia coerulea）40302和雅致小克銀漢霉（Cunni ngnamella elegans）40250為出發(fā)菌株，經(jīng)等離子注入、紫外線、Co-60等方法對菌種進(jìn)行篩選。通過比對4種實驗方法發(fā)現(xiàn)，化學(xué)誘變方法與Co-60誘變導(dǎo)致菌體發(fā)生負(fù)突變的幾率較大，經(jīng)紫外誘變處理后的結(jié)果基本處于正常范圍，等離子注入誘變的正突變率最高。經(jīng)等離子注入誘變處理篩選后，條件為照射劑量20keV，照射時間90s，獲得一株性能穩(wěn)定的銀漢霉突變株，28℃搖瓶發(fā)酵22h，48h后投料，C11β-羥基-16α，17α-環(huán)氧孕酮的轉(zhuǎn)化率達(dá)到5.8％，相比最初的轉(zhuǎn)化率提高了30％。說明采用等離子注入誘變方法是有效的。

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