謝麗斯,張宏梅,劉學(xué)祿,張文艷,黃寶威,許佳晶,鄭添信,劉彥蘭

乳酸菌 (LAB)作為發(fā)酵劑廣泛應(yīng)用于乳制品、肉制品、腌制制品等的食品加工,使這些食品具有各種獨特風(fēng)味。但另一方面,一部分乳酸菌 LAB也可引起食品的腐敗變質(zhì)[1],如蔬菜、肉類食品腐爛變質(zhì)。而且,引起食品變質(zhì)的 LAB均能耐受不同的環(huán)境選擇壓力[2]。生物膜是指細菌粘附于物質(zhì)接觸表面,分泌大量胞外多聚糖基質(zhì),脂質(zhì)蛋白等,包裹自身形成的微生物群落[3]。國外已有一些關(guān)于某種乳酸菌生物成膜的研究報道,但國內(nèi)相關(guān)研究尚少。本研究是從腐敗變質(zhì)的食品中分離篩選乳酸菌,了解不同培養(yǎng)條件下 LAB生物被膜形成的情況,為 LAB生物成膜引起食品變質(zhì)提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品材料

自然環(huán)境中發(fā)酵腐敗的蔬菜 3份:豆角、筍、蘿卜 ,腌豬肉 1份。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

改良MRS培養(yǎng)基配方參見文獻 [4],革蘭氏染色液,95%乙醇,蒸餾水,0.04%溴甲酚綠酒精溶液,1%結(jié)晶紫。

1.1.3 實驗器材

96孔平底細胞培養(yǎng)板 (655180):德國 Greinerbio-one公司;酶標(biāo)儀 (Model 68O):BioRad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

參照文獻 [5]。

1.2.2 腐敗食品中乳酸菌的分離

取發(fā)酵腐敗蔬菜及腌肉預(yù)處理→10倍稀釋法→取樣品稀釋液 250μL涂布于含 0.04%溴甲酚綠的改良MRS固體培養(yǎng)基平板→37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h→挑取出現(xiàn)黃色斑點且有溶鈣圈的單菌落→反復(fù)在培養(yǎng)基上劃線純化→單菌落菌株→甘油保存菌株于 -20℃。

1.2.3 乳酸菌鑒定

革蘭氏染色鏡檢和接觸酶實驗按文獻[4]的方法,乳酸菌產(chǎn)生乳酸的定性檢測采用紙層析法,具體參見文獻 [6],以 1.5%的標(biāo)準(zhǔn)乳酸溶液和 1.5%的標(biāo)準(zhǔn)乙酸溶液分別作為陽、陰性對照。

1.2.4 微孔板法測定生物被膜光密度值 (OD值)

將分離篩選出的乳酸菌活化,37℃培養(yǎng) 48h后,取菌懸液 1μL加入含有改良 MRS液體培養(yǎng)基100μL/孔的標(biāo)準(zhǔn) 96孔板 ,比例為 1∶100,空白對照為未接菌的MRS培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束后用酶標(biāo)儀測定波長 630 nm處的光密度值OD1,倒掉培養(yǎng)基,用蒸餾水水洗 3次去除浮游菌,微孔板在室溫下干燥 2h,加入1%結(jié)晶紫 100μL/孔,放置 20 min后,蒸餾水水洗6～7次去除孔壁染液直至水洗液為無色,孔板在室溫下干燥 30 min,加入 95%乙醇 100μL/孔,微量振蕩器上振蕩 30 min后,用酶標(biāo)儀測定OD630nm,OD2,平行實驗 3次。黏附率為B,可計算為:

OD1c,OD2c為空白對照吸光度值,B＜0.1為不黏附,B≥0.1為黏附成膜,0.1＜B＜1為中等強度黏附成膜,B＞1為強黏附成膜。

1.2.5 培養(yǎng)條件對LAB生物膜生長的影響

在已加入 100μL MRS培養(yǎng)基的 96孔板中接種LAB1μL,將培養(yǎng)板分別置于 25,30,37,42℃培養(yǎng) 24,48,72 h,平行實驗 3次;以 100μL未接菌懸液的孔作為空白對照進行微孔板法光密度測量;將培養(yǎng)基pH分別調(diào)至 4.0,6.8,8.0,重復(fù) 1.2.4操作。

1.2.6 不同濃度葡萄糖對LAB生物膜生長的影響

在 96孔板板中分別加入含不同濃度的葡萄糖(分別設(shè)為 2,4,8,16,32,64,128 mg/mL)的 MRS培養(yǎng)基 100μL,分別接種,在 25,30,37,42℃培養(yǎng) 48 h,測定B值。

1.2.7 不同濃度 NaCl對 LAB生物膜生長的影響

在 96孔板板中分別加入含不同濃度的 NaCl(分別設(shè)為 1.5,3,6,12,24,48,96 mg/mL)的 MRS培養(yǎng)基 100μL,分別接種,在 25,30,37,42℃培養(yǎng) 48 h,測定B值。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵食品中 LAB菌株篩選結(jié)果

分離得到 8株菌,經(jīng)革蘭氏染色鏡檢、接觸酶反應(yīng)和乳酸定性實驗,初步確定 8株乳酸菌。肉類分離菌編號為 L1,L2,蔬菜類分離菌編號為 L3,L4,L5,L6,L7,L8。

2.2 溫度、時間和 pH對 LAB生物被膜形成的影響

37℃時,MRS培養(yǎng)基中乳酸菌在不同培養(yǎng)時間的成膜情況如圖1所示。表明 37℃下 24 h和 48 h培養(yǎng),B增加趨勢平緩,培養(yǎng) 72 h后,B顯著增加。且62.5%(5/8)菌株B＞1,呈強粘附成膜。在其他各個溫度下,表現(xiàn)的不同培養(yǎng)時間的成膜趨勢與 37℃條件下相一致。

圖1 培養(yǎng)時間對LAB生物膜生長的影響

在不同培養(yǎng)溫度下,乳酸菌培養(yǎng) 72 h后的生物被膜形成能力如圖2所示。結(jié)果表明,25℃和 30℃下,所有的 LAB弱成膜作用或不成膜,L2,L3,L4,L7菌株,在 42℃成膜能力較強,L1,L8菌株在 37℃成膜能力最強。一般來講,隨著溫度的升高,培養(yǎng)時間延長,B值呈增加趨勢,37℃和 42℃有利于促進 8株LAB形成大量生物膜。

圖2 培養(yǎng)溫度對LAB生物膜生長的影響

乳酸菌在不同 pH值情況下的生物被膜形成結(jié)果表明,當(dāng) pH 4.0時,在各個試驗溫度下,8株 LAB均能成膜,且以 37℃顯著強黏附,30℃下中等強度成膜黏附,25℃各菌株成膜較弱,抑制或完全不成膜。pH 6.8時,42℃成膜較好,pH 8.0時,乳酸菌不生長或不成膜?？梢?pH值偏酸性時,有利于LAB生長成膜。

2.3 添加不同濃度葡萄糖對 LAB成膜率的影響

在MRS培養(yǎng)基中添加不同濃度的葡萄糖,在不同溫度條件下,培養(yǎng) 48 h,乳酸菌生物被膜的形成情況如圖3所示。結(jié)果表明,42℃,低濃度下,隨著葡萄糖濃度的升高,各個菌株的成膜能力增強,成膜率增加。當(dāng)葡萄糖濃度大于 8 mg/mL時各個菌株成膜能力降低,成膜率有所下降,濃度為 128 mg/mL時成膜率為 0,抑制 LAB形成生物膜;25℃下,隨著糖濃度的增高,成膜率升高,濃度為 128 mg/mL時成膜率達62.5%(5/8);30℃,葡萄糖濃度為 4 mg/mL時,成膜率最高,當(dāng)葡萄糖濃度高于 4 mg/mL成膜率下降;37℃下不添加糖成分成膜率最高,隨著糖濃度的增加,成膜率都較低?？梢娫诓煌瑴囟?添加不同濃度葡萄糖下,實驗菌株生物成膜情況不同,兩者對其生物膜形成是相互作用的。此外,額外加入葡萄糖,構(gòu)建新的營養(yǎng)環(huán)境,單純的富于營養(yǎng)并不一定能促進生物被膜的形成,而且在生物被膜的培養(yǎng)過程中,還需要考慮浮游菌和生物被膜菌之間的營養(yǎng)競爭和代謝廢物累積效應(yīng)。[7]

2.4 不同濃度 NaCl對 LAB成膜率的影響

圖3 不同濃度葡萄糖對 LAB成膜率的影響

培養(yǎng)基中添加不同濃度的 NaCl,乳酸菌在不同溫度下培養(yǎng) 48 h,其生物被膜形成情況如圖4所示。不同的溫度,得到統(tǒng)一的成膜趨勢。即在低濃度NaCl條件下,隨著鹽濃度升高,菌株成膜能力增加,成膜率上升。當(dāng) NaCl濃度大于 24 mg/mL時,隨著濃度增加,抑制菌株成膜。

圖4 不同濃度 NaCl對 LAB成膜率的影響

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn),不同培養(yǎng)條件 (溫度、時間、pH值)、不同營養(yǎng)條件 (葡萄糖、鹽濃度)能影響 LAB生物膜的形成。37℃和 42℃的培養(yǎng)溫度,有利于 LAB生物膜的大量形成,低溫不利于生物膜的形成。LAB本身產(chǎn)乳酸,在 pH偏酸性下,均能生長,且在 37℃和42℃下成膜效果顯著。pH值 8為偏堿性,LAB抑制成膜或完全不成膜。添加糖成分,有利于促進 LAB生物膜形成,高溫,高濃度糖成分,抑制 LAB生物成膜。低濃度的 NaCl可促進 LAB形成生物膜,但高于濃度 2.4%時,就抑制 LAB成膜。不同 LAB菌株對不同葡萄糖濃度成膜效果不同,且與溫度交互作用。可能在培養(yǎng)過程中,浮游菌和生物被膜菌之間的營養(yǎng)競爭和代謝廢物的累積。因此,在食品加工工業(yè)中為了有效預(yù)防自然環(huán)境中乳酸菌造成食品的腐敗變質(zhì),應(yīng)盡可能做好食品原材料的清洗或防腐處理,可添加高濃度的 NaCl和保持低溫來進行食品保藏。而且對于加工設(shè)備和包裝材料也應(yīng)進行清洗殺菌處理,減少糖分殘余,避免LAB生物膜形成。

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[2] Hiromi Kubota,Shouko Senda,Nobuhiko Nomura.Biofilm formation byLactic acid bacteria and resistance to environmental stress[J].The Society for Biotechnology,2008,106(4):381-386.

[3] 李燕杰,杜冰,董吉林,等,食品中細菌生物被膜及其形成機制的研究進展 [J].現(xiàn)代食品科技,2009,25(4):435-437.

[4] 凌代文,東秀珠.乳酸菌細菌分類鑒定及實驗方法[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1999:208-210.

[5] 張宏梅,李發(fā)俊,劉學(xué)祿,等.部分腌漬食品中乳酸菌的分離與耐藥性分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2010,36(4):25-27.

[6] 汪 紅,曹 瑜,羅時寧,等.四川泡菜乳酸菌的分離鑒定及其特性研究[J].四川大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2008,45(6):1 509-1 512.

[7] 段韻涵,韓北忠,楊葆華,等.培養(yǎng)條件對金黃色葡萄球菌生物被膜生長的影響[J].中國釀造,2008(3):17-20.