余茜，趙紅艷，馬淼

（1石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子832003；2新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830054）

甘草是我國傳統(tǒng)的中藥材，具有益氣補(bǔ)中、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和藥性等多種功效［1］，素有“藥中國老”和“十方九草”之稱。黃酮類物質(zhì)是甘草中最主要的活性成分之一，具有抑菌、降壓、保肝、美白、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理作用［2］。

由于其在醫(yī)藥、食品、飲料、化妝品、卷煙等行業(yè)的廣泛用途，日益增長的市場需求以及掠奪式的資源采挖，使我國甘草資源遭受到了嚴(yán)重破壞，野生甘草資源面臨枯竭［3］，自然資源難以滿足目前日益增長的市場需要。保護(hù)和恢復(fù)甘草野生資源，提高甘草產(chǎn)量是目前亟待解決的問題之一。通過生物技術(shù)手段獲得甘草黃酮物質(zhì)的研究已有報道［4－5］，但多為烏拉爾甘草與脹果甘草，且外植體相對單一，以根、下胚軸及子葉為主。

光果甘草（Glycyrrhiza glabra L）是《中國藥典》收錄的三種藥用甘草之一，也被稱為歐甘草，在我國僅零星分布于南北疆，但其黃酮類化合物成分特別，具有很強(qiáng)的皮膚美白效果，對SAS病毒的復(fù)制亦有顯著的抑制作用。然而，有關(guān)光果甘草通過組織培養(yǎng)獲得黃酮類化合物的研究還鮮有報道。本文研究了不同激素組合與不同激素水平對光果甘草根、胚軸、子葉、真葉、節(jié)、以及節(jié)間等6種外植體愈傷組織中總黃酮含量的影響，以期篩選出黃酮高產(chǎn)的最佳外植體和最適培養(yǎng)基激素條件，為光果甘草的進(jìn)一步研究和高效利用提供實(shí)驗證據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

光果甘草種子由石河子大學(xué)馬淼教授鑒別、提供。甲醇、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所。

可見分光光度計Spectrumlad 22PC（上海棱光技術(shù)有限公司）；202型電熱恒溫干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；KQ－300E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH－S恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；SHZ－D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；DNP－9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司）。

1．2 無菌材料的獲得

選取健康、飽滿的光果甘草種子，98%濃硫酸流處理40min，蒸餾水沖洗種子3～5次。在無菌條件下，用無菌水沖洗甘草種子3次，75%乙醇浸泡20～30s，無菌水沖洗3次，0．1%升汞消毒8min，無菌水沖洗4次，用無菌濾紙吸去種子表面水分，接種于MS培養(yǎng)基。先暗培養(yǎng)，待種子萌發(fā)后，轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，獲得無菌苗。

1．3 愈傷組織的誘導(dǎo)

將無菌苗的根、下胚軸、子葉、真葉、節(jié)和節(jié)間切成長度0．5cm左右的片段，分別接入含有不同種類、不同濃度激素的MS培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)5d后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織。每周觀察記錄1次。培養(yǎng)4周，收獲愈傷組織并置于60℃烘箱中烘干至恒重。

培養(yǎng)條件：溫度（25±2）℃，光照強(qiáng)度為40 μmol／m2／s，光照時間12h／d。

1．4 愈傷組織中甘草總黃酮的測定方法

1．4．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以蘆丁為參比標(biāo)準(zhǔn)，用分光光度法測定。精密稱取在120℃下干燥恒重的蘆丁對照品50mg，置25mL容量瓶中，加甲醇適量，置水浴上微熱，使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取10mL置100mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，既得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（每1mL含無水蘆丁0．2mg）。精密量取上述溶液1、2、3、4、5、6mL，分別置25mL容量瓶中，各加水至6．0mL，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，混勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液1mL，混勻，放置6 min，加1mol／L氫氧化鈉試液10mL，再加水至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)試劑為空白。在500 nm處測吸光度。

1．4．2 愈傷組織中總黃酮的提取

精密稱取已研磨的光果甘草愈傷組織0．200g，以75%乙醇作為提取溶劑，料液比為1∶50，浸泡樣品30min后超聲提取40min，過濾。濾渣以1∶30料液比超聲提取30min，過濾。合并兩次濾液，置于25mL容量瓶中，75%乙醇定容。

1．4．3 愈傷組織中總黃酮的測定

精密吸取提取液5mL，加入1mL水，其次同標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的測定方法，在500nm處檢測，平行測定3次?？傸S酮的計算公式如下：

P＝｛［（A＋0．00193）×5×V］／0．01075×m×106｝×100%。

上式中：P為總黃酮含量（%）；A為吸光度值；5為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積（mL）；m為愈傷組織干重（g）。

1．5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有測定數(shù)據(jù)設(shè)3次重復(fù)，用Excel計算平均值，用Origin 7．0繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用SPSS 17．0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y＝0．010705 X－0．00193，R＝0．9999?？梢?，在吸光度在0．084～0．513范圍內(nèi)與蘆丁濃度之間存在良好的線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．1The normal curver of rutin

2．2 6－BA與NAA組合對愈傷組織中總黃酮的影響

方差分析顯示，激素水平（F＝22023．057，P＜0．01）、外植體（F＝3065．834，P＜0．01）、激素水平與外植體的互作（F＝2641．019，P＜0．01）對愈傷組織中總黃酮含量均有極顯著的影響。每種外植體在5種激素水平下，其愈傷組織中總黃酮含量之間都具極顯著差異（表1），但不同外植體愈傷組織黃酮含量隨激素水平的變動格局存在差異。在6－BA 0．5～4．0mg／L與 NAA 1．0mg／L的激素組合中，6－BA 2．0mg／L與 NAA 1．0mg／L為根、下胚軸、子葉和真葉的最佳培養(yǎng)條件，愈傷組織中總黃酮含量最高，分別為1．945%±0．003%、1．771%±0．003%、1．843%和1．984%±0．003%。節(jié)和節(jié)間愈傷組織中總黃酮含量隨著6－BA含量升高而升高，當(dāng)6－BA 4．0mg／L與 NAA 1．0mg／L時，總黃酮含量最高，分別為：1．909%±0．003%和2．316%±0．015%。在 6－BA 與 NAA 組 合中，6－BA 4．0 mg／L與NAA 1．0mg／L為最佳激素水平，節(jié)與節(jié)間為最佳培養(yǎng)材料。

表1 6－BA與NAA組合對愈傷組織總黃酮含量的影響Tab．1The effects of 6－BA and NAA on contect of total flavonoids in callus

2．3 6－BA與2，4－D組合對愈傷組織總黃酮的影響

方差分析顯示，激素水平（F＝3297．928，P＜0．01）、外植體（F＝5200．114，P＜0．01）、激素水平與外植體的互作（F＝410．093，P＜0．01）對愈傷組織中總黃酮含量均有極顯著的影響。6種外植體之間達(dá)到極顯著差異。每種外植體在5種激素水平下，愈傷組織中總黃酮含量都具極顯著差異（表2）。在6－BA 0．5～2．0mg／L與2，4－D 1．0mg／L的激素組合中，6－BA 2．0mg／L與2，4－D 1．0mg／L為根和真葉的最佳培養(yǎng)條件，根和真葉愈傷組織中總黃酮含量最高，為1．135%±0．009%、1．193%±0．006%。節(jié)和節(jié)間隨著6－BA含量的升高，總黃酮含量增加。在6－BA 3．0mg／L與2，4－D 1．0mg／L時，下胚軸、子葉、節(jié)和節(jié)間的總黃酮含量最高，為0．992%±0．003%、1．155%±0．007%、1．593%±0．006%和1．513%±0．003%。在6－BA 與2，4－D 組合中，6－BA 3．0mg／L＋2，4－D 1．0mg／L為最佳激素水平，節(jié)和節(jié)間為最佳培養(yǎng)材料。

表2 6－BA與2，4－D組合對愈傷組織總黃酮含量的影響Tab．2The effects of 6－BA and 2，4－D on contect of total flavonoids in callus

2．4 KT與2，4－D組合對愈傷組織總黃酮的影響

方差分析顯示，激素水平（F＝5426．494，P＜0．01）、外植體（F＝5140．473，P＜0．01）、激素水平與外植體的互作（F＝483．973，P＜0．01）對愈傷組織中總黃酮含量均有極顯著的影響，5種外植體之間達(dá)到極顯著差異。每種外植體在5種激素水平下，愈傷組織中中黃酮含量都具極顯著差異（表3）。在 KT 0．5～3．0mg／L與2，4－D 1．0mg／L的激素組合中，隨KT含量的增加根、子葉、真葉、節(jié)和節(jié)間愈傷組織中的總黃酮含量均呈極顯著遞減趨勢。在KT 0．5mg／L與2，4－D 1．0mg／L上培養(yǎng)時，愈傷組織中總黃酮的含量最高，分別為1．143%±0．003%、1．100% ±0．009%、1．043%±0．003%、1．164%±0．003%、1．124%±0．003%。下胚軸在KT 2．0mg／L與2，4－D 1．0mg／L時，愈傷組織中總黃酮含量達(dá)到最高值，為0．771%±0．003%。在KT與2，4－D組合中，KT 0．5mg／L 與2，4－D 1．0 mg／L為最佳激素水平，節(jié)、根、節(jié)間、子葉為理想培養(yǎng)材料。

表3 KT與2，4－D組合對愈傷組織總黃酮含量的影響Tab．3The effects of KT and 2，4－D on contect of total flavonoids in callus

3 討論

植物激素通過調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中各種酶的合成和活性來影響黃酮類化合物的產(chǎn)量。生長素和細(xì)胞分裂素可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝，并且對植物基因的表達(dá)有顯著的調(diào)節(jié)作用，從而調(diào)控黃酮類化合物合成中某些關(guān)鍵酶的活性［6］。6－BA與NAA組合中，總黃酮含量明顯高于6－BA與2，4－D、KT與2，4－D組合。而且隨著6－BA濃度升高，節(jié)間愈傷組織中總黃酮含量也隨著上升，最高含量為2．316%±0．015%。6種外植體中，節(jié)間是外植體的最佳選擇，6－BA與NAA組合是獲得光果甘草節(jié)間愈傷組織總黃酮培養(yǎng)的最佳激素組合，6－BA 4．0mg／L與NAA 1．0mg／L為最佳激素水平。

野生光果甘草植株中總黃酮含量為3%左右［7－8］。人工栽培3年生光果甘草根中總黃酮含量為1．62%［9］，人工栽培6年生光果甘草根中總黃酮僅為0．31%［10］。通過組織培養(yǎng)4周獲得的愈傷組織中總黃酮含量可高達(dá)2．316%。且6－BA與NAA組合時愈傷組織生物量較高，0．5g左右的外植體在培養(yǎng)4周后，可以得到1g左右愈傷組織的干燥粉末。甘草組培方法不僅極大地縮短了藥材的生產(chǎn)周期，而且節(jié)約了大量土地，有效地緩解了藥、糧爭田的矛盾。因此，通過光果甘草愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)總黃酮的方案是可行的。

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