佟雪紅, 徐世宏, 劉清華, 李 軍, 肖志忠, 馬道遠(yuǎn)

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 鹽城師范學(xué)院, 江蘇 鹽城 224002; 3. 中國科學(xué)院 研究生院, 北京 100039)

大菱鲆早期發(fā)育過程中免疫器官的發(fā)生

佟雪紅1,2,3, 徐世宏1, 劉清華1, 李 軍1, 肖志忠1, 馬道遠(yuǎn)1

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 鹽城師范學(xué)院, 江蘇 鹽城 224002; 3. 中國科學(xué)院 研究生院, 北京 100039)

應(yīng)用組織切片研究了大菱鲆(Scophthalmus maximus)初孵仔魚至 60日齡幼魚免疫器官的發(fā)育過程。結(jié)果表明, 免疫器官原基出現(xiàn)的先后順序是頭腎、脾臟和胸腺。1日齡仔魚可以觀察到頭腎原基, 包含未分化的造血干細(xì)胞。5日齡時(shí), 脾臟原基出現(xiàn), 其淋巴化開始于27日齡且發(fā)育速度較慢。13日齡時(shí), 大菱鲆仔魚胸腺原基出現(xiàn), 且發(fā)育速度較快, 分為外區(qū)和內(nèi)區(qū)。在大菱鲆早期發(fā)育過程中, 胸腺和頭腎之間出現(xiàn)細(xì)胞遷移現(xiàn)象。免疫器官淋巴化的順序是胸腺、頭腎和脾臟。在免疫器官發(fā)育后期, 脾臟和頭腎中均發(fā)現(xiàn)了黑色素-巨噬細(xì)胞中心(MMCs), 脾臟中較豐富, 但在胸腺中尚未發(fā)現(xiàn)。在大菱鲆仔魚早期發(fā)育階段, 免疫器官尚未發(fā)育完善, 非特異性防御機(jī)制起著重要的免疫作用。

大菱鲆(Scophthalmus maximus); 早期發(fā)育階段; 免疫器官; 發(fā)生; 組織學(xué)

魚類免疫系統(tǒng)是機(jī)體識(shí)別和消除“異物”的防衛(wèi)系統(tǒng), 是魚類防止病原入侵的第一防線[1]2,[2]649。參與魚類免疫應(yīng)答的免疫器官主要是腎臟、脾臟、胸腺, 它們是魚類免疫細(xì)胞發(fā)生、分化、成熟和增殖的主要場(chǎng)所。因此, 研究魚體免疫器官的個(gè)體發(fā)生, 是深入認(rèn)識(shí)魚體免疫機(jī)制建立的基礎(chǔ), 對(duì)提高魚苗的培育技術(shù)有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前, 國內(nèi)對(duì)鲇魚(Silurus asotus)[3], 斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)[4]和大黃魚(Pseudosciaena crocea)[5]等免疫器官的發(fā)生發(fā)育規(guī)律進(jìn)行了探討。而對(duì)于鲆鰈魚類免疫系統(tǒng)的研究, 主要見于Chantanachookhin等[6]146和 Liu等[7]對(duì)牙鲆(Paralichthys olivaceus)的研究、Padrós 等[1]2對(duì)大菱鲆(Scophthalmus maximus)的研究、Bowden等[8]對(duì)大西洋庸鰈(Hippoglossus hippoglossus)的報(bào)道及肖志忠等[9]88對(duì)條斑星鰈(Veras per moseri)的研究。

大菱鲆屬鲆科(Bothidae)、菱鲆屬(Scophthalmus),自然分布于東北大西洋沿岸, 其生長(zhǎng)迅速、適應(yīng)低水溫生活, 市場(chǎng)潛力巨大。中國自1992年首次引入以來, 經(jīng)過十幾年的發(fā)展, 大菱鲆的工廠化養(yǎng)殖已成為中國一項(xiàng)新興養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè), 有效推動(dòng)了中國海水養(yǎng)殖第四次浪潮的形成和發(fā)展[10-12]。然而, 大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)也面臨諸多挑戰(zhàn), 魚苗的高畸形率和低成活率仍然是生產(chǎn)實(shí)踐中的難點(diǎn)問題, 推測(cè)部分原因可能與其免疫組織尚未完善以及其免疫功能相對(duì)滯后有關(guān)。要解決這一問題, 需要研究魚類免疫系統(tǒng)的早期發(fā)生, 搞清楚魚類胚胎、仔稚魚和幼魚免疫能力及其免疫系統(tǒng)成熟機(jī)制[13]。作者從免疫器官發(fā)育方面尋找產(chǎn)生這些問題的可能性因素, 旨在為促進(jìn)大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供理論指導(dǎo)。1

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)中大菱鲆魚苗取自山東煙臺(tái)東方海洋科技股份有限公司。仔魚的培育密度是125 尾/升。培育時(shí)的水質(zhì)條件是： 水溫18-19 °C, 溶氧7.0-8.5 mg/L,鹽度30-32, pH 7.7-8.0。魚苗孵化出膜后至40日齡,每天取樣1次; 40日齡以后每2 d 取樣1次, 連續(xù)取樣60 d, 取樣在早晨投喂之前進(jìn)行。樣品用Bouin’s液固定, 石蠟包埋, 用KD1508A輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(浙江金華儀器有限公司生產(chǎn))連續(xù)切片, 分別進(jìn)行橫切(從頭到尾)、縱切(從體左側(cè)到右側(cè))和水平切(從背到腹)方向連續(xù)切片, 切片厚度為4-7 μm, H. E染色, 中性樹膠封片, NIKON SMZ-800顯微鏡下觀察, 照像。

2 結(jié)果

2.1 腎臟的發(fā)生

1日齡仔魚(2.82 mm), 腎為1對(duì)簡(jiǎn)單的直腎管,位于卵黃囊和脊索之間, 頭腎間組織出現(xiàn)未分化的干細(xì)胞(圖 1-1)。2日齡仔魚(2.90 mm), 腎臟向前延伸, 腎管分支形成前腎管; 向后腎管沿著脊椎直抵軀干后部, 開口于肛門。3日齡仔魚(3.29 mm), 前腎管區(qū)間開始出現(xiàn)前腎小管, 但不發(fā)達(dá)。5日齡仔魚(3.62 mm), 前腎小管增多, 管壁內(nèi)可見一些被伊紅染成粉紅色的分泌細(xì)胞, 在前腎管之間可見干細(xì)胞。7日齡時(shí)(3.91 mm), 前腎小管中出現(xiàn)分泌細(xì)胞, 腎間組織出現(xiàn)許多血細(xì)胞, 同時(shí)干細(xì)胞也增多(圖1-2)。8日齡時(shí)(4.1 mm)腎間組織出現(xiàn)淋巴母細(xì)胞。14日齡時(shí)(5.46 mm), 在頭腎部位的腎管區(qū)可見活躍的淋巴細(xì)胞生成(圖1-3)。

圖1 大菱鲆免疫器官的發(fā)育Fig. 1 Development of immune organs in turbot

19日齡時(shí)(7.17 mm), 淋巴細(xì)胞體積變小, 染色變深, 預(yù)示著頭腎淋巴化的開始。22日齡時(shí)(8.62 mm), 頭腎組織體積變大, 前腎小管數(shù)量較多, 管間組織包含大量已淋巴化的小淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞, 同時(shí)出現(xiàn)許多血竇(圖 1-4)。27日齡時(shí)(14.05 mm), 腎管區(qū)間有發(fā)達(dá)的血管, 血管內(nèi)有豐富的紅細(xì)胞(圖1-5)。32日齡時(shí)(17.22 mm), 頭腎淋巴造血組織比率增加, 前腎小管數(shù)量減少, 腎小管上皮細(xì)胞開始退化, 有的細(xì)胞輪廓和界限不清晰, 細(xì)胞的嗜酸性大為增加, 為伊紅深染。此時(shí)體腎組織由大量的腎管、淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞占據(jù), 頭腎在結(jié)構(gòu)上與體腎不同。

隨著生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)行, 37日齡時(shí)(20.59 mm)頭腎組織的血管周圍出現(xiàn)黑色素細(xì)胞, 并形成黑色素-巨噬細(xì)胞中心(melano-macrophage centers,簡(jiǎn)稱MMCs)。50日齡時(shí)(24.76 mm), 頭腎組織可見大量的血竇和血細(xì)胞, 腎小管數(shù)量明顯減少(圖1-6); 體腎中紅細(xì)胞密集, 所占比例增大。60日齡時(shí)(31.71 mm),除了紅細(xì)胞生成集落和各種淋巴細(xì)胞外, 頭腎組織中仍然可見殘存的前腎小管, 但結(jié)構(gòu)退化, 此后頭腎逐漸失去了分泌和排泄的功能, 而成為具有免疫機(jī)能和造血功能的淋巴樣組織。體腎逐步成熟, 作為排泄器官, 體腎組織中出現(xiàn)大量的腎小管, 同時(shí)還存在豐富的血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞, 說明體腎在造血和免疫方面也有一定的作用。

2.2 脾臟的發(fā)生

5日齡時(shí)(3.62 mm), 脾臟原基出現(xiàn), 位于前腸和鰾之間, 呈橢圓形, 被胰臟組織包圍(圖1-7), 由疏松的間充質(zhì)細(xì)胞索和毛細(xì)血管組成, 內(nèi)含少量微嗜堿性細(xì)胞或造血干細(xì)胞。隨著仔魚的生長(zhǎng)發(fā)育, 脾臟逐漸向腹部移動(dòng), 在 9日齡時(shí)(4.47 mm), 脫離胰臟的包圍(圖 1-8)。15日齡時(shí)(5.8 mm), 脾臟體積變大, 此時(shí)可見活躍的紅細(xì)胞生成, 嗜堿性細(xì)胞和紅細(xì)胞數(shù)量增多。同時(shí)成纖維細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞和紅細(xì)胞形成了疏松的細(xì)胞索(圖1-9)。

27日齡時(shí)(14.05 mm), 脾臟體積顯著增大, 嗜堿性細(xì)胞明顯增多且進(jìn)一步分化, 體積變小, 預(yù)示了脾臟的淋巴化。同時(shí)可見許多微血管, 內(nèi)含豐富的紅細(xì)胞, 并形成原始的脾竇(圖 1-10)。34日齡時(shí)(17.97 mm), 脾臟結(jié)構(gòu)緊密, 脾竇數(shù)量增加。網(wǎng)狀細(xì)胞通過胞質(zhì)擴(kuò)張形成網(wǎng)狀組織。微血管發(fā)達(dá), 淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞更為豐富, 此時(shí)紅細(xì)胞數(shù)量明顯占優(yōu)勢(shì),為優(yōu)勢(shì)細(xì)胞。40日齡時(shí)(21.4 mm), 紅細(xì)胞和類紅細(xì)胞進(jìn)一步增多, 血管密集。50至60日齡(24.76-31.71 mm), 脾臟的結(jié)構(gòu)與成體類似, 脾臟的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)十分發(fā)達(dá), 表明其具有造血和免疫功能。在脾竇附近可見大量含黑色素的巨噬細(xì)胞并形成 MMCs (圖1-11)。隨著魚體的生長(zhǎng)發(fā)育, 脾臟的組織學(xué)變化很少,主要是細(xì)胞組織的進(jìn)一步生長(zhǎng)和脾臟體積的增大。

2.3 胸腺的發(fā)生

13日齡時(shí)(5.4 mm), 大菱鲆仔魚中胸腺原基出現(xiàn), 為兩側(cè)對(duì)稱的1對(duì)器官, 位于鰓腔上角背側(cè), 靠近鰓蓋骨的背關(guān)節(jié)(圖1-12)。胸腺腹面為一層扁平上皮與鰓腔分隔。胸腺由未分化的嗜堿性淋巴母細(xì)胞組成, 染色較深。17日齡時(shí)(6.7 mm), 胸腺明顯, 開始出現(xiàn)小淋巴細(xì)胞, 此時(shí)尚無內(nèi)區(qū)(髓質(zhì))和外區(qū)(皮質(zhì))之分。23日齡時(shí)(9.2 mm), 胸腺和頭腎位置較近,可見細(xì)胞遷移現(xiàn)象, 胸腺結(jié)構(gòu)變得緊密(圖1-13)。

隨著生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)行, 在27日齡時(shí)(14.05 mm),胸腺外被一層較薄的、含分泌樣細(xì)胞的上皮, 并初步分區(qū)為內(nèi)區(qū)和外區(qū), 但此時(shí)內(nèi)區(qū)和外區(qū)之間沒有明顯的界限。在31日齡時(shí)(16.92 mm), 胸腺中出現(xiàn)血管, 內(nèi)含血細(xì)胞。內(nèi)區(qū)和外區(qū)主要由淋巴細(xì)胞和網(wǎng)狀上皮細(xì)胞構(gòu)成。內(nèi)區(qū)部分染色較淺, 網(wǎng)狀上皮細(xì)胞和類肌細(xì)胞相對(duì)較多, 淋巴細(xì)胞大而染色淺、數(shù)量少且排列松散; 外區(qū)部分染色深, 淋巴細(xì)胞小而染色深、數(shù)量多且排列密集, 無結(jié)締組織。35日齡時(shí)(18.73 mm), 胸腺中出現(xiàn)許多血管, 包含血細(xì)胞, 內(nèi)區(qū)和外區(qū)分區(qū)逐漸明顯。同時(shí)可見胸腺和頭腎組織間明顯的細(xì)胞遷移現(xiàn)象, 即連接頭腎與胸腺的細(xì)胞“橋”(圖 1-14)。40 日齡時(shí)(21.4 mm), 外區(qū)和內(nèi)區(qū)的淋巴細(xì)胞分布密集, 內(nèi)區(qū)之下主要由一些稀疏的結(jié)締組織構(gòu)成, 結(jié)締組織形成被膜將胸腺分割成許多不完全的胸腺小葉, 每個(gè)小葉可分為外區(qū)和內(nèi)區(qū), 小葉間的外區(qū)組織互相連接(圖 1-15)。50-60日齡(24.76 mm-31.71 mm), 幼魚的胸腺與成魚相似, 外區(qū)主要由淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞構(gòu)成, 外被一層黏膜分泌樣細(xì)胞上皮層; 內(nèi)區(qū)部分淋巴細(xì)胞稀疏而網(wǎng)狀上皮細(xì)胞較多, 同時(shí)可見大量的血管和血細(xì)胞延伸在胸腺實(shí)質(zhì)中(圖1-16)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中, 大菱鲆淋巴器官原基出現(xiàn)的順序是頭腎、脾臟和胸腺, 這跟Padrós等[1]12在大菱鲆中得出的試驗(yàn)結(jié)果一致, 也跟已報(bào)道的大多數(shù)海水魚類如金鯛(Sparus aurata)[14]40、鱸魚(Dicentrarchus labrax)[15,16]和大西洋鱈魚(Gadus morhua)[17]512等類似; 但與羅非魚(Apistogramma alacrina)[18]和鯉魚(Cyprimus carpio)[19]等淡水魚不同, 其免疫器官原基的出現(xiàn)順序?yàn)樾叵佟㈩^腎和脾臟。大菱鲆免疫器官淋巴化的順序是胸腺、頭腎和脾臟, 這跟大多數(shù)硬骨魚類免疫器官淋巴化的順序一致。但比較特殊的是大西洋鱈魚, 其免疫器官淋巴化的順序是頭腎、脾臟、胸腺; 而條斑星鰈, 其首先淋巴化的器官是頭腎,然后是胸腺, 最后是脾臟; 推測(cè)原因可能是大西洋鱈魚(Gadus morhuaL)和條斑星鰈對(duì)冷水溫養(yǎng)殖環(huán)境長(zhǎng)期適應(yīng)的結(jié)果, 即水溫影響了免疫器官的發(fā)生和分化[9]90, [17]515。

本實(shí)驗(yàn)中組織學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示, 在 23日齡時(shí),大菱鲆胸腺和頭腎之間可見細(xì)胞遷移現(xiàn)象, 即連接頭腎與胸腺的細(xì)胞“橋”, 在金鯛等硬骨魚中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象[14]45。另外, 本研究中大菱鲆頭腎組織在1日齡的仔魚中就存在未分化的造血干細(xì)胞, 而胸腺在13日齡時(shí)出現(xiàn), 說明頭腎的干細(xì)胞并非來自于胸腺; 而且細(xì)胞橋的存在證實(shí)了大菱鲆在早期發(fā)育過程中, 頭腎的造血干細(xì)胞會(huì)遷移到胸腺中, 控制胸腺的分化, 這跟Padrós等[1]12在大菱鲆中得出的試驗(yàn)結(jié)果一致, 同時(shí)也支持了“頭腎和胸腺是同一種干細(xì)胞分化出的不同器官”的觀點(diǎn)[20]140,[21]78。

黑色素-巨噬細(xì)胞中心是存在于真骨魚類免疫器官如腎臟、脾臟及軟骨魚類肝臟中的一種結(jié)構(gòu)[22]。研究表明, MMCs有儲(chǔ)存鐵血黃素的作用并參與了紅細(xì)胞的凋亡過程[23,24]。本試驗(yàn)中, 大菱鲆在脾臟和頭腎中均發(fā)現(xiàn) MMCs, 以脾臟中較為豐富, 但在胸腺中尚未發(fā)現(xiàn)此類細(xì)胞。但牙鲆和真鯛(Pagrosomus major)與此不同, 兩者腎臟中 MMCs比脾臟中豐富[6]147。造成MMCs形態(tài)和數(shù)量差異的原因, 可能跟物種和魚類的養(yǎng)殖環(huán)境及生態(tài)習(xí)性有關(guān)。另外, 魚類中MMCs通常在淋巴器官發(fā)育成熟后的幼魚階段出現(xiàn), 本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與此相類似; 但鮭鱒魚通常在仔魚開口時(shí)出現(xiàn)MMCs[25]。

大菱鲆在早期生活階段要經(jīng)歷變態(tài)期, 魚苗的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變, 器官發(fā)育尚未完善, 此時(shí)魚苗很脆弱、死亡率較高。組織學(xué)顯示, 大菱鲆淋巴器官的成熟要在變態(tài)完成后, 而免疫功能的發(fā)育完善要在幼魚階段。因此, 作者認(rèn)為大菱鲆仔稚魚階段出現(xiàn)的較低成活率可能與其免疫器官尚未發(fā)育完善以及免疫功能相對(duì)滯后有關(guān)。在早期生活階段, 魚苗特異性免疫受到限制, 因此, 非特異性防御機(jī)制起著重要的免疫作用, 如： 巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、溶菌酶以及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)等[6]145。上述非特異性細(xì)胞不僅對(duì)抗原有吞噬作用, 還具有處理抗原和將抗原決定簇呈遞給淋巴細(xì)胞的潛在功能, 對(duì)于早期階段特異性免疫的缺乏起了一定的補(bǔ)償作用[26-28]。另外, 母源性免疫因子在魚類生活早期也起著同樣重要的免疫保護(hù)作用[4]824,[20]136。通過母體免疫方法增強(qiáng)魚體先天性的抵抗能力, 以及通過對(duì)魚苗進(jìn)行有效的免疫接種提高魚體自身的免疫力才能從根本上減少發(fā)病率,實(shí)現(xiàn)健康養(yǎng)殖。

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Ontogeny of immune organs during early developmental stages of turbot

TONG Xue-hong1,2,3, XU Shi-hong1, LIU Qing-hua1, LI Jun1, XIAO Zhi-zhong1, MA Dao-yuan1
(1. Institute of Oceanology, the Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Yancheng Teachers University, Yancheng 224002, China; 3. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China)

Jun., 14, 2010

turbot (Scophthalmus maximus); early developmental stage; immune organs; ontogeny; histology

A histological study was made for the development of immune organs in turbotScophthalmus maximusfrom hatching to 60 days after hatching (DAH). The sequence of immune organ anlages appearance were head kidney, spleen and thymus. At 1 DAH, head kidney anlage and primordial stem cells were observed. Spleen anlage was present at 5 DAH, it became lymphoid at 27 DAH and developed slowly. Progenitor thymus appeared at 13 DAH and grew quickly. An outer zone and an inner zone in the thymus were observed. Cell migration occurred between thymus and head kidney. The first functional lymphoid organ was thymus followed by head kidney and spleen.During the posterior developmental period of the immune organs, the melano-macrophage centers (MMCs) were found in spleen and head kidney, but not in thymus. The abundance in spleen was higher. During early developmental stages of turbot larvae, immune organs did not grow perfectly and non-specific systems may play an important role in the immunocompetence mechanisms.

S961.6

A

1000-3096(2011)01-0062-06

2010-06-14;

2010-11-15

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(nycytx-50); 國家863“十一五”計(jì)劃資助項(xiàng)目(2006AA10A404)

佟雪紅(1979-), 女, 山東濰坊人, 博士, 主要從事海洋生物學(xué)研究, 電話： 0532-82898716, E-mail： txh113005@163.com; 李軍,通信作者, 研究員, E-mail： junli@ms.qdio.ac.cn

譚雪靜)