鄧 勃

(清華大學化學系,北京 100084)

儀器定量分析中幾個問題的探討

鄧 勃

(清華大學化學系,北京 100084)

詳細介紹了分析方法的評價指標,包括檢出限、測定限、靈敏度、精密度、準確度、動態(tài)范圍和線性范圍、抗干擾能力等,單因素優(yōu)化方法與加標回收實驗評定測定結果準確度的可靠性,并就分析工作中遇到的一些實際問題進行了討論。

檢出限;測定限;靈敏度;精密度;準確度;動態(tài)范圍和線性范圍;抗干擾能力;優(yōu)化;加標回收

O657

A

2095-1035(2011)02-0001-05

1 引言

近年來,環(huán)境污染和保護、食品安全、醫(yī)療保健等越來越受到人們的普遍關注,分析檢測工作也因此受到社會、各級政府和檢測部門前所未有的重視。分析工作者每年為社會提供了大量的檢測數(shù)據(jù),在各種公開的學術期刊上發(fā)表了許多研發(fā)報告,為促進科學技術的進步、國民經(jīng)濟和生產(chǎn)的發(fā)展、保障人民的健康都做出了重要的貢獻,與此同時,也促進了分析檢測技術的快速發(fā)展。從讀到的很有限文獻和檢測報告中發(fā)現(xiàn),存在一些值得有待進一步深入探討的共性問題,希望引起大家的重視。本文擬針對儀器定量分析,與分析工作者共同探討分析方法評價、試驗參數(shù)優(yōu)化和加標回收實驗的可靠性等方面的問題。

2 分析方法的評價

隨著分析儀器和分析技術的進步,新的分析方法不斷出現(xiàn)。面對著大量的分析方法,如何選擇已有的或研發(fā)新的適合于完成特定分析任務的分析方法,是分析人員所關注的問題。這里首先遇到的一個問題是用什么標準或參數(shù)來評價一個分析方法。評價一個分析方法至少包括三方面:分析方法的檢測能力、用該分析方法測得結果的可靠性與分析方法的適用性。

2.1 良好的檢測能力

分析方法的檢測能力決定了分析方法能否滿足實際分析要求,是評價分析方法的基本指標。表征分析方法檢測能力的參數(shù)有檢出限(detection limit)、測定限(determination limit)和靈敏度(sensitivity)。

2.1.1 檢出限

分析方法的檢出限是指能用該方法以適當置信度檢出被測組分的最低質(zhì)量或最低濃度。本定義中所謂‘檢出’是指由最低檢出質(zhì)量mDL和最低檢出濃度cDL產(chǎn)生的分析信號顯著地區(qū)別于不含被測組分的‘空白’樣產(chǎn)生的‘空白’噪聲,而且是以所要求的置信度(通常取置信度99.7%)檢出的,因此,可由最小檢測信號值與‘空白’噪聲導出檢出限的關系式。

式中ADL是在檢出限水平測定的分析信號平均值,Ab是‘空白’樣產(chǎn)生的信號平均值,sb是‘空白’噪聲(標準偏差),b是校正曲線在低量值區(qū)域的斜率。

測定量值在檢出限水平的樣品,測定值的離散性較大,有些文章因此就認為檢出限是一個定性指標。定性指標通常只是就被測組分在樣品中是否存在做出結論,而由上述檢出限定義可知,檢出限能用量值定量表征,因此,不能認為檢出限是一個定性指標。檢出限也不是實際測定的最小質(zhì)量或最小濃度值,而是一個由分析信號以一定置信度導出的統(tǒng)計值。

值得注意的是,第一,由上述關系式計算的檢出限,取置信系數(shù)k=3,置信度為99.7%,是在測定誤差遵從正態(tài)分布的條件下才成立,而在實際測定中,是在低質(zhì)量或低濃度水平進行有限次測定,測定誤差更可能是遵從非正態(tài)分布,置信度達不到99.7%。第二,由式(1)從差值(ADL-Ab)導出檢出限時,設測定‘空白’樣品信號Ab的標準偏差為sb,測定量值為檢出限水平的樣品分析信號ADL的標準偏差亦為sb,按照誤差傳遞原理,測定差值(ADL-Ab)信號的標準偏差應為s=2sb=1.414sb,要使信號ADL能以置信度為99.7%顯著地從Ab中檢出,至少應使(ADL-Ab)≥3s=4.24sb。第三,在實際工作中,基體匹配的‘空白’樣品不容易找到,通常用不含被測組分的純?nèi)芤鹤鳛椤瞻住瘶悠?進行若干次(也不是進行足夠多次比如20次)測量,測得的標準偏差sb往往偏小,求得的檢出限值比預期的要好些。要使量值在檢出限水平的測定值有足夠的可靠性,計算檢出限的置信系數(shù)k至少要大于4.24sb。

分析方法的檢出限受分析儀器能檢測最小信號能力的制約,也依賴于分析條件的優(yōu)選。檢出限可以作為分析人員選擇和評估分析方法能否滿足實際分析工作要求的依據(jù),要對在不同儀器和條件下得到的檢出限進行定量比較,在事實上存在一定的困難。

2.1.2 測定限

測定限是以一定置信度實際能定量測定的被測組分的最小質(zhì)量或最小濃度。它不僅受測定噪聲的制約(這一點與檢出限是類似的),也依賴于‘空白’絕對值(這一點是與檢出限不同的)。由于分析過程中試劑、器皿和環(huán)境的污染,‘空白’值增大,會增加有用分析信號與‘空白’信號分辨的困難。只有當有用分析信號比‘空白’信號大到一定程度后,才能可靠地從‘空白’信號中分辨出有用分析信號。假定ADL/Ab=k為從‘空白’信號中分辨出有用分析信號的閾值,代入⑴式,得到的定量測定被測組分的最小質(zhì)量或最小濃度分別是

‘空白’噪聲越大,要可靠地從‘空白’信號中分辨出有用分析信號,需要k值越大,測定限越高;‘空白’信號值Ab越大,測定限也越高,從高‘空白’值比從低‘空白’值中分辨小分析信號更困難,這是不難理解的。因此,在實際測定中減小玷污、降低‘空白’信號值Ab對改善測定限具有重要意義,這也是分析痕量組分時要求給出‘空白’值的原因。

2.1.3 靈敏度

靈敏度是指被測組分質(zhì)量或濃度改變一個單位時分析信號的變化量,即校正曲線的斜率,反映了對量值變化的分辨和檢測能力。靈敏度不僅影響檢出限,也影響校正曲線的線性范圍。靈敏度受儀器施加于檢測器上負高壓的影響,施加的負高壓高,會提高靈敏度,但同時使檢測器的噪聲增大,因此,依靠提高施加于檢測器負高壓來提高靈敏度,以期改善檢出限是不可取的。而且,還會增大分析信號的不穩(wěn)定性。只有通過優(yōu)化實驗條件提高靈敏度,才對改善檢出限有效。

2.2 測定結果的可靠性

測定結果的可靠性要求測定值離散性小,測定平均值盡可能接近真值,即平均值是真值的無偏估計值。因此,精密度高、準確度好就成了選擇分析方法的主要依據(jù)和評價分析方法的主要指標。

2.2.1 精密度

精密度(p recision)是指多次測定時各次測定量值之間相互一致的程度,反映測定過程中隨機誤差的大小,通常用標準偏差或相對標準偏差表示。精密度與系統(tǒng)誤差無關,不需在消除系統(tǒng)誤差的前提下去求精密度。但是,精密度與被測定的量值水平有關,報告標準偏差或相對標準偏差必須說明是在什么量值水平下得到的,而且注明重復測定次數(shù)。不指明被測定量值水平的標準偏差或相對標準偏差是不能說明問題的,嚴格地說是沒有實際意義的。

重復性也是測定量值之間相互一致程度的量度,但精密度不等同于重復性。重復性r有專門的定義,是指在同一實驗室同一分析人員用同一分析儀器和方法對同一量相繼進行兩次測定時,兩次重復測定值按指定概率的容許差,在置信度為95%時,r=1.962sr=2.83sr,sr是單次測定的標準偏差,2sr是兩次重復測定值之差值的標準偏差。在原子光譜分析儀器性能評定中,有一個穩(wěn)定性指標,現(xiàn)在的評估方法是連續(xù)測定30 min和2 h,考察吸收值的波動性,分別作為儀器短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性指標。這里有一個誤解,將長期穩(wěn)定性誤解為長時間穩(wěn)定性。連續(xù)測定時間由30 min延長至2 h,還是長時間穩(wěn)定性,而不是長期穩(wěn)定性,仍用標準偏差表征。長期穩(wěn)定性的含義是指在不同時間段內(nèi),按一定程序進行一定時間的相繼測量,各段時間之間測定量值的一致性,用并合標準偏差ˉs表征。

式中m是不同時間段,ni是第i個時間段的測定次數(shù),xij是第i個時間段第j次測定值,ˉxi是第i個時間段ni次測定的平均值。

2.2.2 準確度

準確度(accuracy)是測定的量值平均值與真值相符合的程度,表征測定值的系統(tǒng)誤差,以誤差或相對誤差表示?，F(xiàn)在國內(nèi)絕大多數(shù)分析化學教材、文獻和有關國標中都采用準確度這一術語表述系統(tǒng)誤差,但仍有些文章和國標中使用正確性表示系統(tǒng)誤差,將準確度看成是正確性與精密度的綜合。用正確性不如用準確度來表征系統(tǒng)誤差更確切,從中文詞義考慮,正確與錯誤是相對的,準確與不準確是相對的,一個測定值偏離真值較遠,誤差較大,可以說測定值不準確,但不能說測定值是錯誤的。全國科學技術名詞審定委員會第二屆化學名詞審定委員會在修訂的化學名詞術語中,也采用了準確度一詞,定義為在一定測量條件下測量值與被測定量的真值之間一致的程度。

如果以正確性表示系統(tǒng)誤差,將準確度看成是正確性與精密度的綜合。正確性自然用誤差或相對誤差表示,那么準確度以什么量值表示?正確性與精密度如何綜合?準確度與合成標準不確定度又是什么關系?都值得考慮和商榷。

無論從用詞的確切性,還是依照約定俗成的原則,采用準確度比正確性表征系統(tǒng)誤差更科學合理。

2.3 方法的適用性

任何一個分析方法必須實用,這是對分析方法的基本要求。適用性要求分析方法有較寬的校正曲線線性范圍(linear range)或動態(tài)范圍(dynamic range),有較強的抗干擾能力(anti-interference ability),能適用于多種類型的樣品,且簡便和易于操作。

現(xiàn)在有些文獻中,將校正曲線的動態(tài)范圍與線性范圍等同起來,事實上,校正曲線的動態(tài)范圍與線性范圍是有區(qū)別的,不能混淆。前者指響應值隨測定量值基本呈現(xiàn)線性變化,在校正曲線的高量值區(qū)域常略有彎曲。應該指出的是,用相關系數(shù)檢驗合格的校正曲線,只表明所建立的校正曲線在統(tǒng)計上是有意義的,確定的是校正曲線動態(tài)范圍,如圖1中的虛線,相關系數(shù)是r=0.9534,動態(tài)范圍上限是0.48μg/mL。確定校正曲線的線性范圍在統(tǒng)計上需進行擬合優(yōu)度檢驗,如圖1的實線,線性范圍上限是0.16μg/mL。動態(tài)范圍大于線性范圍。

圖1 校正曲線的動態(tài)范圍與線性范圍Figure 1.The dynam ic range and the linear range for a calibration curve.

抗干擾能力可用選擇性系數(shù),或更直接的用允許的干擾物質(zhì)量表征。研究抗干擾能力時,不能忽略干擾組分之間的交互作用。干擾組分單獨存在與其他干擾組分共同存在時產(chǎn)生的干擾效應是不同的,可能相互抵消,也可能協(xié)同增強。當因素之間存在交互效應時,應在因素共同存在的情況下考察干擾效應。

3 試驗參數(shù)優(yōu)化方法

研發(fā)新的分析方法,或采用已有的分析方法分析樣品,都需要對影響分析結果的試驗參數(shù)進行優(yōu)化。試驗參數(shù)的優(yōu)化方法很多,如單因素輪換優(yōu)化法、正交試驗設計優(yōu)化法、均勻設計優(yōu)化法、單純形優(yōu)化法等,但在我國多數(shù)實驗室分析人員最常使用的參數(shù)優(yōu)化方法是單因素輪換優(yōu)化法(single factor alternative op timization method),而使用多因素同時優(yōu)化方法的還相當少見。單因素輪換優(yōu)化法是固定其他參數(shù)不變,只改變一個參數(shù)的水平,求得該因素優(yōu)化水平,將其固定在優(yōu)化水平,再依次一個個參數(shù)進行優(yōu)化,最后將各參數(shù)的優(yōu)化水平組合在一起作為最佳測定條件。這種優(yōu)化參數(shù)的方法簡便,易于操作。但這種優(yōu)化方法有兩個主要的缺點。

(1)忽略了因素之間的交互效應。分析人員都知道,在分析中因素之間的交互效應是普遍存在的,在火焰原子吸收光譜法(FAAS)中,燈電流、燃氣、助燃氣、燃燒器高度、進樣量等影響吸收值的因素中,燈電流與其它因素之間不存在交互效應,可用單因素輪換優(yōu)化法優(yōu)選最佳燈電流,而燃氣、助燃氣、燃燒器高度、進樣量之間存在交互效應,固定不同因素的不同參數(shù)水平,得到的各參數(shù)的優(yōu)化組合是不同的。如用FAAS法測定鎳電解液中的銅,乙炔流量固定在1.5 L/min,合適的空氣流量是9.0 L/min,乙炔流量固定在2.5 L/min,合適的空氣流量是11.0 L/min。又如在石墨爐原子吸收光譜(GFAAS)分析中,灰化溫度、灰化時間和進樣量之間也存在交互效應,不同的進樣量,在不同的灰化溫度需要不同的灰化時間;在光度分析中,即使加入相同量的顯色劑,也會因試液中酸度不同解離出來有效顯色基團濃度不同,產(chǎn)生的顯色強度不同。在因素之間無交互效應時,單因素輪換優(yōu)化法與多因素同時優(yōu)化結果是一致的。

(2)單因素輪換優(yōu)化法得到的優(yōu)化條件是一定條件下的局部優(yōu)化而非全局最優(yōu)條件,只有將單因數(shù)優(yōu)化得到的幾組局部優(yōu)化條件再進行二次優(yōu)選,才能求得全局或接近全局優(yōu)化條件。在現(xiàn)在發(fā)表的一些文章中,隨意將單因素輪換優(yōu)化條件組合說成是最佳測定條件是不恰當?shù)摹?/p>

4 用加標回收率評定測定結果準確度的可靠性

分析測試是為科研和社會提供第一手原始數(shù)據(jù)和資料,是作出科學、公正結論的基礎。當測試結果中存在系統(tǒng)誤差產(chǎn)生的偏倚,使測定結果無法溯源,甚至導致錯誤的結論。因此,在分析測試中需要用合適的方法來評估測定結果的準確度。評估測定結果準確度最直接有效的方法是使用標準物質(zhì)(或質(zhì)控樣),將基體、量值、賦存形態(tài)與被測定試樣相匹配的標準物質(zhì)與試樣,同時經(jīng)歷全分析過程,如果測得標準物質(zhì)的量值在一定置信度下經(jīng)t檢驗與標準物質(zhì)的標準量值沒有顯著性差異,說明測定方法和測定過程不存在系統(tǒng)誤差,反之,表明測定方法、或測定過程、或測定方法和測定過程同時存在系統(tǒng)誤差。通過標準物質(zhì)可將測定結果溯源到SI單位。采用標準分析方法和被檢查的分析方法同時測定同一試樣,比較兩種分析方法的測定結果,如果兩者的測定結果在一定置信度水平經(jīng)t檢驗沒有顯著性差異,說明被檢查的分析方法不存在系統(tǒng)誤差,其測定結果是可靠的。但合適的標準物質(zhì)和標準方法在許多情況下并不一定能找得到,特別是在研究新材料或新分析方法時,沒有標準物質(zhì)或標準方法。因此,在更多情況下都采用加標回收法來評定測定結果的準確度。

在分析測試中,影響測定結果準確度的是系統(tǒng)誤差產(chǎn)生的偏倚,分為固定偏倚和相對偏倚,分別由固定系統(tǒng)誤差和比例系統(tǒng)誤差產(chǎn)生。如果測定結果中存在固定偏倚,就相當于在樣品測定值x0中加入了一個固定量xa,等效于校正曲線平移一個xa量,而斜率不變。xa不隨加標量而改變,加標前、后都增加或減小了相同的一個量xa,加標前后兩次測定值相減,固定偏倚被低償,加入的標準量值的回收率理所當然是100%。由此可見,加標回收實驗不能發(fā)現(xiàn)固定偏倚,加標回收率100%也不能證明加標前的測定量值x0不存在固定偏倚。如果測定結果中存在相對偏倚,校正曲線截距不變而斜率隨著標準加入量發(fā)生變化,這時回收率將不再是100%,也就是說,加標回收能發(fā)現(xiàn)比例系統(tǒng)誤差產(chǎn)生的相對偏倚。加標回收只能對加標量值測定是否存在相對偏倚做結論,而不能直接對加標前的測定量值是否存在相對偏倚做出結論。

加標回收實驗的目的是要通過加標量的回收率來評定加標前的測定量值的可靠性。如果加標前、后量值水平的回收率是一樣的,局外因素對回收率的影響不隨加入量而改變,就可以用加標量的回收率推論加標前的測定量值的回收率,這就要求加入量與原含量必須是很接近的,加標量通常是原測定量的相同量值或是原測定量值的2～3倍。因為局外因素對量值相差很大的兩個不同含量水平的回收率產(chǎn)生的影響是不同的。

對于在實際工作中如何來分辨固定偏倚或相對偏倚?可用純?nèi)芤汉蜆悠啡芤和瑫r建立校正曲線,如果兩條線是平行的,表明只存在固定偏倚,不能用加標回收實驗來評定加標前測定量值的準確度;如果兩條線是交叉的,可用加標回收實驗來評定加標前測定量值的準確度。

下面通過一個實例來進一步具體討論加標回收的可靠性問題。某人用ICP-AES測定鉛錫焊料中鐵,測定值是3.7μg,加入50.0μg鐵標準后,測定值是51.2μg?；厥樟渴?1.2-3.7=47.5μg,回收率是95.0%。該文作者因此做出結論:測定結果不存在系統(tǒng)誤差?，F(xiàn)在來分析這一實驗結果及其結論。

(1)加標后進行第二次測定,損失了2.5μg鐵,都歸屬于新準確加入的50μg鐵的損失,回收率為95%。這意味著第一次測定值3.7μg是準確的。前面提到,加標回收的目的就是要證明測定值3.7μg是否準確?現(xiàn)在在證明之前事先就假定測定值3.7μg是準確的,將要證明的當做證明的前提,在邏輯上是不合理的。從實際考慮,如果測定值3.7μg是準確的,就用不著再進行加標回收實驗來證明測定值3.7μg是否準確。

(2)加標50μg鐵是準確的,第一次測定值3.7μg是待證實的,加入50μg鐵后再對53.7μg鐵進行測定,損失2.5μg鐵,既有新加入50μg鐵的貢獻,又有原測定量值3.7μg鐵的貢獻(損失量是隨被測定量值水平而改變),損失的2.5μg鐵應歸屬于總量53.7μg鐵中的損失,回收率應是 51.2/53.7= 95.34%,而不應是95%?；厥章视嬎憬Y果雖然相差不大,但涉及到回收率的計算方法,值得考慮和商榷。

(3)如果產(chǎn)生的偏倚是由固定系統(tǒng)誤差引起的,損失量是固定的,不再隨加入量而改變,準確加入50μg鐵,回收也應是50μg鐵,回收率應是100%。即使這樣,也只能就所加鐵標量而言不存在系統(tǒng)誤差,也不能說明加標前測定值不存在系統(tǒng)誤差。

(4)實驗設計不合理,加標量選擇過大。當存在比例系統(tǒng)誤差時,產(chǎn)生的相對偏倚是隨鐵量值水平而改變的,高量值水平與低量值水平的回收率是不一樣的,將50μg鐵水平的回收率代表3.7μg鐵水平的回收率是有問題的。加標量應選擇在加標前測定量值的附近,在這種情況下,用加標回收率代表加標前測定量值的回收率一般是可以接受的。這是應用加標回收實驗評定測定值準確度的前提。

5 結語

在研發(fā)新的分析方法時,應給出評價分析方法的全面評價指標。檢出限是一個由分析信號導出的統(tǒng)計值,是一個定量指標。測定限受‘空白’絕對值的限制。報告標準偏差或相對標準偏差必須說明是在什么量值水平下得到的,而且注明重復測定次數(shù)。長期精密度不同于長時間精密度,用并合標準偏差表征。采用準確度比正確性表征系統(tǒng)誤差更科學合理。校正曲線的動態(tài)范圍與線性范圍是有區(qū)別的,不能混淆。研究抗干擾能力時,不能忽略干擾組分之間的交互作用。

單因素輪換優(yōu)化法是簡便有效的優(yōu)化方法,在因素之間無交互效應時,與多因素同時優(yōu)化結果是一致的。單因素輪換優(yōu)化法得到的優(yōu)化條件是一定條件下的局部優(yōu)化而非全局最優(yōu)條件,只有將單因數(shù)優(yōu)化得到的幾組局部優(yōu)化條件再進行二次優(yōu)選,才能求得全局或接近全局的優(yōu)化條件。

用加標回收實驗檢查和評定測定量值的準確度,只適用于存在比例系統(tǒng)誤差產(chǎn)生相對偏倚的情況,不能發(fā)現(xiàn)固定系統(tǒng)誤差產(chǎn)生的固定偏倚。加標量應選擇在加標前測定量值的附近,這是用加標回收率推論加標前測定值回收率的前提。

[1]鄧勃.分析測試數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理方法[M].北京:清華大學出版社,1995:291-303.

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The Discussion of Some Problems in Quantitative Instrumental Analysis

DENGBo
(Chemistry department,Tsinghua University,Beijing100084,China)

The evaluation parameters for an analytical method,including detection limit,determination limit,sensitivity,p recision,accuracy,dynamic range,linear range and anti-interference power etc.,were introduced in detail.The single factor alternative op timization method was reviewed and the reliability of accuracy assessment using the standard addition experiment w as evaluated.In addition,some p ractical p roblem s that encountered during instrumental analysis p rocesses were discussed aswell.

detection limit;determination lim it;sensitivity;p recision;accuracy;dynam ic range;linear range;anti-interference ability;op timization;recovery of standard addition

10.3969/j.issn.2095-1035.2011.02.0001

2011-02-11

2011-03-12

鄧勃,男,清華大學教授,主要從事光譜分析。E-mail:dengbo@mail.tsinghua.edu.cn