劉 超,李小慧,李 靜

生物表面活性劑 (Biosurfactants)是表面活性劑家族中的后起之秀,它是由微生物所產(chǎn)生的一類具有表面活性的生物大分子物質(zhì)。與化學(xué)合成的表面活性劑相比,生物表面活性劑除具有降低表面張力、穩(wěn)定乳化液和增加泡沫等相同作用外,還具有一般化學(xué)合成表面活性劑所不具備的無毒、易生物降解等優(yōu)點(diǎn),愈來愈受到人們的青睞[1]。目前生產(chǎn)成本過高是生物表面活性劑走向市場(chǎng)的主要障礙,所以優(yōu)化培養(yǎng)基、提高生物表面活性劑產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本是其能否進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。

目前有關(guān)提高微生物表面活性劑產(chǎn)量的研究比較多,歸納起來主要有以下幾方面:(1)產(chǎn)優(yōu)良表面活性劑菌株的篩選。自然界存在很多產(chǎn)表面活性物質(zhì)的微生物 ,篩選出優(yōu)良的產(chǎn)表面活性劑菌株是提高微生物表面活性劑產(chǎn)量的基礎(chǔ)。其中比較典型的菌種包括了產(chǎn)鼠李糖脂 (rhamnolipid)的假單胞菌屬 (Pseudom onass p.),產(chǎn)表面活性素 (surfactin)的枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis),產(chǎn)槐糖脂(Sophor oli pids)的球擬酵母 (Torulopsis bombicola),產(chǎn)海藻糖脂的紅球菌屬 (Rhodococcus erythropolis)等。目前已有很多關(guān)于篩選生物表面活性劑生產(chǎn)菌株的報(bào)道[2-4]。(2)碳源、氮源的優(yōu)化。碳源是影響微生物表面活性劑產(chǎn)量的一個(gè)非常重要的因素,選擇合適的碳源,可以大大提高微生物表面活性劑的產(chǎn)量。甘油、甘露醇、葡萄糖、原油等均可作為某些產(chǎn)表面活性劑菌株的碳源[5-7]。(3)利用誘變、基因工程等科技手段構(gòu)建超級(jí)細(xì)菌以提高微生物表面活性劑產(chǎn)量[9-10]。

微量元素是微生物生長必不可少的條件,其中的某些金屬離子以輔基或輔酶的形式參與微生物體某些酶系的合成,對(duì)微生物體的新陳代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用。目前關(guān)于金屬離子對(duì)微生物表面活性劑生產(chǎn)調(diào)節(jié)的研究報(bào)道還比較少,本文研究了五種金屬離子對(duì) S5菌產(chǎn)表面活性劑性能的影響。

1 試驗(yàn)部分

1.1 菌種和儀器

菌種來源:S5、Y2、Y8菌株來自實(shí)驗(yàn)室分離保存的菌株,4℃保存于牛肉膏蛋白胨斜面上,并定期轉(zhuǎn)接。

儀器:pH計(jì)、高壓滅菌鍋、離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、分光光度計(jì)、表面張力儀(自制)。

1.2 優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件的搖瓶試驗(yàn)

種子培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)方法:牛肉膏 3.0 g,蛋白胨 10.0 g,NaCl 5.0 g,pH為 7.2～7.4,121℃高壓蒸汽滅菌 30 min。在種子培養(yǎng)基中接種 S5菌,培養(yǎng)條件為:溫度 30℃,轉(zhuǎn)速 180 r/min,時(shí)間 30 h。

產(chǎn)表面活性劑發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法:無機(jī)鹽培養(yǎng)基 1:(1)磷酸鹽緩沖液:K2HPO4·H2O 21.75 g, Na2HPO4·12H2O 33.4 g,KH2PO48.7 g,NH4Cl 5.0 g,溶于 1 000 mL蒸餾水中。(2)硫酸鎂溶液: MgSO422.4 g溶于 1 000 mL蒸餾水中。(3)氯化鐵溶液:FeCl30.25 g溶于 1 000 mL蒸餾水中。(4)微量元素。(5)氯化鈣溶液:CaCl236.4 g溶于1 000 mL蒸餾水中。依次加入上述硫酸鎂溶液3.0 mL,微量元素溶液 1.0 mL,氯化鐵溶液 1.0 mL,氯化鈣溶液 1.0 mL,磷酸鹽緩沖溶液 5.0 mL,調(diào)節(jié)pH為 9,用蒸餾水定容至 1 000 mL。經(jīng)高壓蒸汽滅菌備用。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基 2:(1)磷酸鹽緩沖液:K2HPO462 g,NaH2PO433 g,調(diào)節(jié) pH為 7.5,溶于 1 000 mL蒸餾水中。(2)硫酸鎂溶液:MgSO4·7H2O 24.64 g溶于 1 000 mL蒸餾水中。(3)氯化鈣溶液: CaCl2·2H2O 14.72 g溶于 1 000 mL蒸餾水中。(4)微量元素。依次加入上述硫酸鎂溶液 0.5 mL,氯化鈣溶液 0.1 mL,微量元素 1 mL,磷酸鹽緩沖液25 mL,NH4NO31.004 g,溶于 1 000 mL蒸餾水中,經(jīng)高壓蒸汽滅菌備用。

培養(yǎng)方法:碳源用量:固體 20 g/L;液體:5% (以葡萄糖為碳源時(shí),采用低壓滅菌;以淀粉為碳源時(shí),先用少許無機(jī)鹽將淀粉調(diào)成糊狀,并將其加入微沸的無機(jī)鹽中,攪拌使其溶解)。溫度30℃,搖床轉(zhuǎn)速:180 r/min;發(fā)酵時(shí)間 80 h;做有關(guān)金屬離子對(duì) S5產(chǎn)表面活性劑影響的實(shí)驗(yàn)時(shí),用電阻率為15 MΩ·m的純水配制。

1.3 表面張力、排油圈及微生物表面活性劑的提取

表面張力的測(cè)定:使用最大氣泡法儀器進(jìn)行測(cè)量。

排油圈測(cè)定方法:加蒸餾水 15 mL于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中,并在水面中心處緩慢加 0.5 mL橄欖油,待油膜均勻平鋪在培養(yǎng)皿表面時(shí),在油膜中心加 0.1 mL離心后的搖瓶發(fā)酵液,中心油膜被擠向四周形成一個(gè)圓圈,圓圈直徑與表面活性劑的含量和活性成正比,測(cè)量直徑大小。

表面活性劑提取方法:取出搖瓶發(fā)酵液, 10 000 r/m in離心 10 m in除菌體;取其上清液用6 mol/L HCl調(diào) pH至 2.0,將上清液置于 125 mL的分液漏斗,用 CH2Cl2等體積萃取兩次,分層后收集下層液體,冷卻干燥得到生物表面活性劑的粗品。

1.4 水體石油的微生物降解試驗(yàn)

石油烴降解培養(yǎng)基:將一定量的無機(jī)鹽 2培養(yǎng)基于 121℃滅菌 30 min,接種前加入一定量石油醚溶液使體系油濃度為 1 g/L。

降解體系石油含量測(cè)定方法:重量法[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 S5菌在無機(jī)鹽 1和無機(jī)鹽 2中生長狀況的對(duì)比(表1)

表1 S5在不同碳源上的生長情況

本實(shí)驗(yàn)室有兩組可供大部分細(xì)菌良好生長的無機(jī)鹽配方,選取 4種不同的碳源,分別用無機(jī)鹽 1和無機(jī)鹽 2配成發(fā)酵體系,測(cè)試在不同無機(jī)鹽和碳源上 S5的生長狀況和表面活性劑生產(chǎn)情況以篩選出適合 S5產(chǎn)表面活性劑的無機(jī)鹽配方和碳源。由表1可以看出:在不同的碳源上 S5菌的生長狀況差異非常明顯。以淀粉和乙二醇為碳源時(shí),在無機(jī)鹽 1和無機(jī)鹽 2上的 OD值依次為:0.116、0.109、0.091、0.056,說明 S5菌幾乎不能利用這兩種碳源。以葡萄糖和甘油為碳源時(shí),在無機(jī)鹽 1和 2中 S5菌生長良好,OD值依次達(dá)到 1.285、2.301、1.593和 0.503 (稀釋 10倍后),并且也產(chǎn)生了表面活性劑,發(fā)酵液表面張力均下降到了 31 mN/m左右。在無機(jī)鹽 2中以甘油為碳源時(shí)表面活性劑產(chǎn)量達(dá)最高值6.37 g/L,說明甘油可作為 S5菌生產(chǎn)表面活性劑的最佳碳源。由表1還可以看出,無論是以葡萄糖還是以甘油為碳源時(shí),無機(jī)鹽 2中表面活性劑產(chǎn)量均高于無機(jī)鹽 1中的產(chǎn)量,說明無機(jī)鹽 2更適合作為S5菌產(chǎn)表面活性劑的培養(yǎng)基。

2.2 金屬離子對(duì) S5產(chǎn)表面活性劑的影響

由以上試驗(yàn)可知,無機(jī)鹽 2比無機(jī)鹽 1更適合作為 S5產(chǎn)表面活性劑的培養(yǎng)基。仔細(xì)對(duì)比兩組無機(jī)鹽配方可知,無機(jī)鹽 2的微量元素較無機(jī)鹽 1豐富,可能是某些金屬離子是控制 S5產(chǎn)表面活性劑的酶所必需的,其含量的增加大大增強(qiáng)了 S5產(chǎn)表面活性劑的能力,使得無機(jī)鹽 2中表面活性劑的產(chǎn)量高于無機(jī)鹽 1。本試驗(yàn)旨在驗(yàn)證無機(jī)鹽 2中的五種金屬離子對(duì) S5產(chǎn)表面活性劑性能的影響,試驗(yàn)結(jié)果如圖1～3所示。

通過對(duì)比以上 6組不同的發(fā)酵體系,五種金屬離子均對(duì) S5的生長起到一定的作用。缺少五種金屬離子中的任何一種,都會(huì)使發(fā)酵體系的OD值、pH及表面活性劑產(chǎn)量較對(duì)照組有顯著下降。因此上述五種金屬離子對(duì) S5產(chǎn)表面活性劑起到了明顯的促進(jìn)作用。

圖1 金屬離子對(duì)發(fā)酵液pH的影響

圖2 金屬離子對(duì)發(fā)酵液OD的影響

圖3 金屬離子對(duì)表面活性劑產(chǎn)量的影響

2.3 多因素正交優(yōu)化試驗(yàn)

以上試驗(yàn)表明,五種金屬離子對(duì) S5產(chǎn)表面活性劑均有一定的影響,為了確定各金屬離子的最佳濃度,本試驗(yàn)采用五因素四水平對(duì)上述無機(jī)鹽 2中五種金屬離子的濃度進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照表2配制 16組發(fā)酵培養(yǎng)基 ,條件均與無機(jī)鹽 2保持相同。在培養(yǎng)基上接種 S5菌并進(jìn)行微生物表面活性劑的發(fā)酵生產(chǎn) ,發(fā)酵時(shí)間為 80 h。正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

從表3可以看出 ,15號(hào)培養(yǎng)基的表面活性劑產(chǎn)量最高。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析 ,其中k1～k4分別為每一列因素中第 1～4種水平所對(duì)應(yīng)的表面活性劑產(chǎn)量的總和。比較每一種因素中各個(gè)水平所對(duì)應(yīng)的 k值 ,可得出各因素的最優(yōu)組合水平為 A3B3C2D4E3。即發(fā)酵體系中 Co2+、B3+、Fe2+、Cu2+、Ni2+的濃度依次為 0.022、0.022、0.906、0.018、0.012 mg/L時(shí)表面活性劑產(chǎn)量達(dá)到最高。根據(jù)極差分析,各因素對(duì)產(chǎn)表面活性劑影響大小順序依次為:Fe2+>Co2+>B3+>Cu2+>Ni2+。因該方案不在已做的 16組試驗(yàn)中 ,因此 ,補(bǔ)充以 A3B3C2D4E3為培養(yǎng)基的表面活性劑生產(chǎn)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果為:表面張力31.23 mN/m,pH=6.83,表面活性劑產(chǎn)量為12.73 g/L,比 15號(hào)培養(yǎng)基的要高。

2.4 S5產(chǎn)表面活性劑對(duì)水體中微生物降解石油烴的促進(jìn)作用

烴類的憎水性結(jié)構(gòu) ,是其難以生物降解的主要原因 ,而生物表面活性劑可以增加憎水性有機(jī)化合物與水之間的接觸面 ,提高憎水性有機(jī)化合物的水溶性 ,從而促進(jìn)微生物對(duì)它的吸收和降解。本試驗(yàn)探究了 S5產(chǎn)表面活性劑對(duì)兩株石油烴降解菌 Y2、Y8降解石油烴的促進(jìn)作用。

Y2和 Y8降解石油烴過程中,以加入微生物表面活性劑的和不加活性劑的作對(duì)照試驗(yàn),加入活性劑的一組在降解一開始就可觀察到石油被乳化在水體中,整個(gè)降解體系呈均勻的墨黑色,隨著時(shí)間的推移顏色逐漸變淺,到第 5天,降解體系呈深棕色。沒有加入表面活性劑的降解體系,在降解第 1天石油漂浮在水體表面,油水分解明顯,并有大量石油黏附在三角瓶壁,降解第 2天仍有大量石油漂浮于水體表面,但有一部分石油以小絮體的形式懸浮在水體中,第 3天到第 5天懸浮在水體中的石油絮體顆粒進(jìn)一步增加,并且絮體顆粒逐漸變小,試驗(yàn)結(jié)果如圖4、5所示。

圖4 Y8在不同表面活性劑濃度下降解水體中石油烴

圖5 Y2在不同表面活性劑濃度下降解水體中石油烴

由圖4可知,與對(duì)照相比微生物表面活性劑的加入確實(shí)促進(jìn)了 Y8對(duì)石油烴的降解。加入表面活性劑的體系石油降解速率明顯快于對(duì)照組,尤其是在前三天效果尤為顯著。在第 3天時(shí),表面活性劑含量為 300 mg/L和 50 mg/L的降解體系中石油含量分別降低到 0.53 g/L和 0.65 g/L,較空白體系0.85 g/L降低了許多。在第 3天以后表面活性劑的促進(jìn)作用有所減弱,可能是由于在微生物的作用下,表面活性劑被分解,促進(jìn)作用減弱。

由圖5可知,微生物表面活性劑對(duì) Y2降解水體中石油烴也同樣起到了一定的促進(jìn)作用,與 Y8的降解趨勢(shì)相似,也是在降解的前期促進(jìn)作用明顯,在降解后期促進(jìn)作用有所減弱。

3 結(jié)論

(1)S5菌產(chǎn)表面活性劑的最佳碳源為甘油,最佳無機(jī)鹽培養(yǎng)基組成為無機(jī)鹽 2。并且無機(jī)鹽 2中五種金屬離子 Co2+、B3+、Fe2+、Cu2+、Ni2+的含量對(duì)S5菌產(chǎn)表面活性劑的性能有顯著影響,發(fā)酵液中五種金屬離子的最佳濃度依次為:0.022、0.022、0.906、0.018、0.012 mg/L。

(2)S5菌產(chǎn)生的表面活性劑能夠增加石油在水中的溶解度,對(duì)石油降解菌 Y2、Y8降解水體中石油烴有明顯的促進(jìn)作用。

[1]Rosenberg E,Ron E Z.High-and-low-molecularmassmicrobial surfactants[J].Applied Microbiology and Biotechnology,1999,52(2):154-162.

[2]Mulligan C N,CooperD Q,Neufeld R J.Selection of microbes producing biosurfactants in media without hydrocarbons[J].J Ferment Technol,1984,62:311-314.

[3]Jain D K,Collins-Thompson D J,Lee H,et al.A dropcollapsing test for screening surfactant-producing microorganis ms[J].J MicrobiolMethods,2003,13:271 -229.

[4]胡浩 ,沈紅 ,王浩 ,等 .一株原油降黏細(xì)菌的篩選[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào) ,2002,37(3):276-278.

[5]Yateem A,BaIba M T,Alshayli Y,et al. Isolation and characterization of biosurfactant-producing bacteria from oil contaminated soil[J].Soil and Sediment Contamination,2002,11(1):41-55.

[6]Ferraz C,DeArújoA A,Pastore GM.The influence of vegetable oils on biosurfactant production by Serratia marcescens[J].ApplBiochem Biotechnol,2002,100(1– 3): 841– 848.

[7]Bonilla M,Olivaro C,Corona M,et al.Production and characterization of a new bioemulsifier from Pseudomonas putidaML2[J].ApplMicrobiol,2005,98:456– 463.

[8]KochA,KappeliO,FiechterA,et al.Hydrocarbon assimilation and biosurfactant production in Pseudomonas aeruginosa mutants[J].Bacteriol,1991,173:4212– 4219.

[9]Mulligan C N,CooperD Q,Neufeld R J.Selection of microbes producing biosurfactants in media without hydrocarbons[J].Fer ment Technol,1984,62:311-314.

[10]Catherine N,Mulligan Terry Y K,Chow Bernard F Gibbs. Enhanced biosurfactant production by a mutant Bacillus subtilis strain[J].ApplMicrobiolBiotechnol,2003,31: 486-489.

[11]國家環(huán)境保護(hù)總局水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法編委會(huì).水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法[M].4版.北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社.2002:490-491.