宋翔，魏文靜，涂鄭禹，孫玉春，陳寧

（1.天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300402；2.天津科技大學(xué)，天津300222）

以Kla值優(yōu)化L-谷氨酸發(fā)酵的供氧條件

宋翔1，魏文靜1，涂鄭禹1，孫玉春1，陳寧2

（1.天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300402；2.天津科技大學(xué)，天津300222）

以Kla（體積溶氧系數(shù)）值為重要參考對(duì)黃色短桿菌進(jìn)行了分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程中有關(guān)供氧條件的研究。在10L臺(tái)式發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，當(dāng)Kla為377 h-1左右時(shí)，供氧比較適宜，可發(fā)酵產(chǎn)生130g/LL-谷氨酸。

L-谷氨酸；供氧；發(fā)酵；Kla值

谷氨酸化學(xué)名為α-氨基戊二酸，它是生物機(jī)體內(nèi)氮代謝的基本氨基酸之一，在代謝上具有十分重要的意義。谷氨酸具有多種生理功能[，廣泛用于食品，醫(yī)藥及飼料行業(yè)。谷氨酸發(fā)酵作為典型的代謝控制發(fā)酵，是工業(yè)微生物發(fā)酵工藝與過(guò)程控制的典型代表。1957年Kinoshita等[1]創(chuàng)立微生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸，開(kāi)創(chuàng)了發(fā)酵法氨基酸工業(yè)化生產(chǎn)的新紀(jì)元，使得發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸成為工業(yè)微生物最重要的研究領(lǐng)域之一[2～4]。

反應(yīng)器中氧參與菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物形成和細(xì)胞代謝。氧是難溶于水的氣體，在室溫及常壓下，純氧的溶解度僅為36 mg/L，空氣中氧的溶解度僅為8 mg/L，當(dāng)水中溶有糖或其它鹽類(lèi)時(shí)，氧的溶解度更低。在通風(fēng)發(fā)酵中如何控制培養(yǎng)基中溶氧水平，對(duì)好氧氨基酸發(fā)酵非常關(guān)鍵，尤其在放大過(guò)程中，因反應(yīng)器規(guī)模不同，造成溶氧水平的差異，是導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)果不能重復(fù)的一個(gè)重要原因。在反應(yīng)器放大研究中，Kla是一個(gè)重要的參數(shù)，不同規(guī)模的反應(yīng)器中，氧傳遞系數(shù)與發(fā)酵結(jié)果之間存在著對(duì)應(yīng)關(guān)系，目前Kla放大準(zhǔn)則已成為生物化工界一個(gè)廣泛接受的觀點(diǎn)?？梢?jiàn)在小型反應(yīng)器中研究溶氧對(duì)發(fā)酵的影響，尋求最適Kla值不僅是發(fā)酵工業(yè)研究的關(guān)鍵之一，而且是反應(yīng)器放大研究的重要基礎(chǔ)。在谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中，前期主要為菌體生長(zhǎng)階段，需要一定量氧參與，若氧的供應(yīng)受到限制，就會(huì)影響菌體生長(zhǎng)，進(jìn)而影響到最終的L-谷氨酸產(chǎn)量;在L-谷氨酸合成階段，氧也是必不可少的底物之一，供氧不足會(huì)嚴(yán)重影響L-谷氨酸的合成。

1 材料與方法

1.1 菌種

黃色短桿菌

1.2 培養(yǎng)基

[5]。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 斜面活化培養(yǎng)：32℃培養(yǎng)20 h。

1.3.2 種子培養(yǎng)：500mL圓底三角瓶中裝液量30mL，9層紗布封口，置巡回式搖床（200 r/min）上，32℃振蕩培養(yǎng)8 h。

1.3.310 L罐發(fā)酵：中裝液量為6 L，接種量為10%，溫度有34℃程序升溫至39℃，通風(fēng)比為1∶1，流加氨水控制pH在7.0～7.2，攪拌轉(zhuǎn)速根據(jù)要求而定。

1.4 分析方法

1.4.1 pH的測(cè)定:用pH6.4～8.0精密pH試紙和發(fā)酵罐配套pH電極測(cè)定。

1.4.2 殘?zhí)菧y(cè)定:采用SBA-40C生物傳感分析儀測(cè)定。

1.4.3 菌體濃度測(cè)定:稀釋20倍，用752分光光度計(jì)在波長(zhǎng)620 nm處測(cè)定。

1.4.4 谷氨酸含量的測(cè)定：采用SBA-40C生物傳感分析儀測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 搖瓶溶氧系數(shù)的測(cè)定

為了給發(fā)酵放大提供依據(jù)，首先用亞硫酸鹽氧化法對(duì)500 mL圓底三角瓶溶氧性能進(jìn)行了測(cè)定。在相同搖瓶轉(zhuǎn)速條件下（回轉(zhuǎn)式搖床200 r/min），測(cè)定了不同裝液量的搖瓶溶氧系數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 搖瓶溶氧系數(shù)的確定

通過(guò)溶解氧性能測(cè)定可以看出，在固定搖床轉(zhuǎn)速的條件下，對(duì)于同種規(guī)格的500 mL圓底三角瓶，減少裝液量可以使溶氧加大。

2.210 L發(fā)酵罐溶氧系數(shù)的測(cè)定

要將搖瓶中的各項(xiàng)優(yōu)化條件在大規(guī)模培養(yǎng)中完全重現(xiàn)是相當(dāng)困難的，尤其是溶氧的控制尤為關(guān)鍵。為了使微生物培養(yǎng)過(guò)程溶解氧參數(shù)系統(tǒng)化，并有依據(jù)地將其放大進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，在相同的通氣量的條件下（200 L/h），本試驗(yàn)對(duì)不同的轉(zhuǎn)速下10 L發(fā)酵罐的溶氧系數(shù)進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表210 L發(fā)酵罐溶氧系數(shù)的測(cè)定

在相同的通氣量的條件下，從試驗(yàn)測(cè)定的反應(yīng)器中不同轉(zhuǎn)速下的溶氧系數(shù)可知，當(dāng)10 L發(fā)酵罐裝液量為6 L，轉(zhuǎn)速為500 r/min，通氣量為200 L/h的溶氧系數(shù)，與回轉(zhuǎn)式搖床500 mL三角瓶裝液量30 mL時(shí)的溶氧系數(shù)接近。

2.3 Kla值與發(fā)酵罐溶氧的關(guān)系

已有的研究報(bào)道認(rèn)為較低的溶氧有利于L-谷氨酸的積累。通過(guò)以上的實(shí)驗(yàn)研究表明搖瓶發(fā)酵過(guò)程中確定的最佳裝液量為30 mL，溶氧系數(shù)為390 h-1，對(duì)應(yīng)發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速為500 r/min左右。試驗(yàn)中通過(guò)改變攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)控制不同的Kla值，在發(fā)酵培養(yǎng)基組成和其它發(fā)酵條件相同的情況下，考察了不同Kla值對(duì)應(yīng)發(fā)酵過(guò)程溶氧變化的情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 10 L發(fā)酵罐不同Kla下溶解氧的變化

如圖1所示，在控制不同的Kla值的發(fā)酵過(guò)程中，溶氧均表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律，但發(fā)酵的不同階段對(duì)氧的需求不同。在發(fā)酵初期（0～12 h），菌體好氧速率明顯快于供氧速率，表現(xiàn)為溶氧的迅速下降；而18 h后，好氧速率和供氧速率基本保持平衡。發(fā)酵末期（30 h后），溶氧略有回升;發(fā)酵結(jié)束溶氧達(dá)10%左右。

2.4 Kla值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

試驗(yàn)中通過(guò)改變攪拌轉(zhuǎn)速控制不同的Kla值，從而達(dá)到控制發(fā)酵液的溶氧水平。發(fā)現(xiàn)過(guò)高或過(guò)低的溶氧對(duì)發(fā)酵均不利；當(dāng)溶氧很低時(shí)（Kla=289 h-1）對(duì)發(fā)酵尤為不利，表現(xiàn)為產(chǎn)酸水平降低和發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)；將Kla值控制在377～512 h-1之間時(shí)，發(fā)酵結(jié)果較好，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同Kla值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

2.5 不同Kla值時(shí)的發(fā)酵菌體生長(zhǎng)曲線(xiàn)

圖2為發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)曲線(xiàn)，在不同的Kla值時(shí)（除非Kla很小），菌體的生長(zhǎng)量均能達(dá)到基本相同的飽和值，但菌體的生長(zhǎng)速率是不同的。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)Kla=377 h-1時(shí)，菌體的比生長(zhǎng)速率最大；而過(guò)高的Kla值反而對(duì)菌體的生長(zhǎng)有抑制作用。

圖2 不同Kla值時(shí)的發(fā)酵菌體生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.6 L-谷氨酸補(bǔ)料分批發(fā)酵過(guò)程曲線(xiàn)

以黃色短桿菌GDK-9為試驗(yàn)菌株，在7L自控發(fā)酵罐上進(jìn)行L-谷氨酸發(fā)酵試驗(yàn)并繪制其發(fā)酵過(guò)程曲線(xiàn)，結(jié)果如圖3所示。

圖310 L發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程曲線(xiàn)

由圖3看出，0～2h為菌體生長(zhǎng)的延滯期,此時(shí)菌體耗糖速率較慢,主要用于長(zhǎng)菌,基本不產(chǎn)酸；2～ 12 h為菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,耗糖速率最快,并急劇產(chǎn)酸；12～36 h菌體進(jìn)入穩(wěn)定期,在此階段,菌體耗糖速率較快,L-谷氨酸大量合成,36 h后為菌體衰退期,這時(shí)菌體耗糖速率減慢,L-谷氨酸合成緩慢或基本不合成。發(fā)酵36 h,L-谷氨酸產(chǎn)量為130 g/L。

參考文獻(xiàn)：

［1］Kinoshita,S.,Udaka,S.,Shimono,M.,1957.Studies on the amino acid fermentation.I.Production of L-glutamic acid by various microorganisms[J].Gen.Appl.Microbiol.1957,3,193-205.

［2］Arnold L.Demain.Small bugs,big business the economic of the microbe[J].Biotechnology Advances,2000,18:499-514.

［3］ThomasHermann.Industrialproductionofaminoacidsbycoryneform bacteria[J].JournalofBiotechnology,2003,104:155-172.

［4］Volker F Wendisch,Michael Bott,Bernhard J Eikmanns.Metabolic engineering of Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum for biotechnological production of organic acids and amino acids[J]. Current Opinion in Microbiology,2006,92:68-274.

［5］郜培,陸靜波,段作營(yíng),等.溶氧濃度對(duì)谷氨酸發(fā)醉關(guān)鍵酶的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2005,31（10）：72-75.

Optimization of oxygen supply of L-glutamic acid fermentation by Kla value

SONG Xiang1,WEI Wen-jing1,TU Zheng-yu1,SUN Yu-chun1,CHEN Ning2
(1.Tianjin Bohai Vocational Technical College,Tianjin 300402,China；2.Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300222,China)

The oxygen supply of L-glutamic acid fermentation was optimized by Kla value.The research indicated that when the Kla value was about 377 h-1,the oxygen supply was most suitable for the fermentation and 130g/L L-glutamic acid was accumulated.

L-glutamic acid；oxygen supply；fermentation；Kla value

10.3969/j.issn.1008-1267.2011.03.008

TQ922+.1

A

1008-1267（2011）03-0026-03

2011-01-28