艾慶輝,苗又青,麥康森

(中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,山東青島266003)

中國是世界水產養(yǎng)殖大國,總產量占世界產量的70%左右[1]。隨著水產養(yǎng)殖規(guī)模的擴大以及養(yǎng)殖模式的轉變,水產養(yǎng)殖業(yè)對飼料的依賴性逐漸增強。在集約化魚類生產中飼料成本往往占到總成本的50%以上[2]。由于水生動物特殊的生理代謝方式,蛋白質作為最重要的營養(yǎng)元素之一,在飼料中占有極其重要的地位——魚類飼料蛋白質含量約占飼料干重的29%～55%[3]。魚粉因蛋白質含量高、氨基酸平衡、易于消化吸收等被認為是最好的飼料蛋白源之一。隨著集約化養(yǎng)殖的迅猛發(fā)展,魚粉的需求量急劇上升。然而,由于過度捕撈、環(huán)境污染以及氣候變化等導致世界魚粉產量逐漸下降而價格逐年上升,從而嚴重制約了水產養(yǎng)殖業(yè)的進一步發(fā)展。因此,尋找適宜的蛋白源以替代魚粉就成為亟待解決的重要問題。然而植物蛋白源中往往含有多種抗營養(yǎng)因子,限制了在飼料中的應用[4-6]。

單寧(Tannin,tannic acid)又稱單寧酸或鞣酸,是一類水溶性、分子量在500～3 000 Da之間的酚類化合物[7-8]。單寧在植物界中廣泛分布,是一種重要的次級代謝產物,也是除木質素以外含量最多的一類植物酚類物質。單寧主要存在于植物界的高等植物,特別是雙子葉植物,如豆科(Leguminosae)、桃金娘科(M yrtaceae)等的樹皮、葉子、木質部、果實以及種子等幾乎各個組織器官中[7,9]。

單寧按結構可以分為水解單寧(Hydrolysable tannins,H T)、縮合單寧(Condensed tannins,CT)以及復雜單寧(Comp lex tannins)。水解單寧是沒食子酸或鞣花酸與糖(一般是葡萄糖)或多元酚形成的酯。水解單寧分子量相對較小,具有很強的極性,可溶于水,與蛋白質分子中的親核基團(-NH2、-SH)形成不溶性復合物,也可與金屬離子等結合形成沉淀。水解單寧易于被酶(單寧酶)、酸和堿水解[10]。水解產物為沒食子酸或鞣花酸及葡萄糖。因此,水解單寧根據水解產物可以進一步分為沒食子單寧(Gallotannins)和鞣花單寧(Ellagitannins)?？s合單寧,又稱原花色素,大多是通過C4-C6或C4-C8鍵連接的寡聚或多聚黃烷-3-醇或黃烷-3,4-二醇?？s合單寧相對分子量較大,一般不容易被水解。復雜單寧是介于水解單寧和縮合單寧之間的一種單寧,含有水解單寧和縮合單寧組成單位,具有前兩者的共性[7-8,11](見表1)。

1 單寧的抗營養(yǎng)性

單寧因具有苦澀味道并能和蛋白質、糖類、金屬離子等結合而成為難以消化吸收的復合物,故而會降低動物的攝食率以及飼料中某些營養(yǎng)元素的生物利用率,加之其本身和代謝產物往往能對動物產生毒害作用,因此被認為是抗營養(yǎng)因子。

1.1 降低攝食率

目前,大多數研究報道指出單寧能降低動物攝食率。這些動物既包括單胃動物,如雞[12]、羅非魚(Oreochrom ismossambicus)[13]、鯉[14]和東方田鼠(M icrotus fortis)[15]等,又包括反芻動物,如綿羊[16-18]等。單寧對攝食率的影響可能與實驗動物的種類以及飼料單寧的種類和含量有關。研究結果顯示,相對于水解單寧,縮合單寧對羅非魚攝食率有顯著抑制作用,而對鯉的研究卻得出了相反的結論[13-14],這表明,攝食率因單寧和動物的種類而異。目前,尚不清楚產生這種差異的原因。飼料單寧含量對實驗動物攝食率有顯著影響。Barry和Duncan[19]用不同單寧含量的Lotus pedunculatus飼喂綿羊,發(fā)現綿羊對低單寧飼料和高單寧飼料(分別為45.6和105.9 g/kg干物質)干物質的攝食率分別為83.3和75.0(g/kg體質量0.75)。M cNabb等[20]用單寧含量為55 g/kg干物質的Lotus pedunculatus飼喂綿羊,發(fā)現與對照組(聚乙二醇,PEG處理組)相比,綿羊的攝食率無顯著變化。單寧具收斂性,口感苦澀,影響適口性[21],因此,飼料的適口性隨其單寧含量逐漸增加而降低。這可能是降低動物攝食率的重要原因。飼料中單寧含量低時對動物攝食率不產生負面影響的原因可能是,動物在進化過程中對單寧產生了一定程度的適應,比如,通過唾液腺分泌的富脯氨酸蛋白(Proline-rich p rotein,PRP)結合飼料單寧[22],以改善其適口性提高攝食率。然而,也有研究表明,適口性可能不是影響攝食率的主要因素。Narjisse等[23]研究發(fā)現,灌喂低劑量(0.1%)單寧后,綿羊的攝食率降低,產生這種結果的原因可能是單寧增加了消化道排空的時間,而產生“飽”的感覺進而降低攝食率[24]。最新研究表明,灌喂高劑量的單寧(3.0 g/kg體質量)后,由此造成的消化系統等損傷可能是導致攝食率降低的最主要原因[17]。

表1 單寧的主要種類及來源[7]Table 1 Themajor groups of tannins with their rep resentative types and main sources

1.2 降低飼料營養(yǎng)物質的生物利用率

目前,已有大量研究表明單寧能降低動物對營養(yǎng)物質的生物利用率。單寧主要降低蛋白質并在不同程度上影響其他營養(yǎng)物質的利用率[25-27]。盡管相關研究還不深入,然而,目前的研究報道顯示,單寧對營養(yǎng)物質的生物利用率的抑制作用可能具有多方面的原因,主要可能有以下幾個方面:

1)降低營養(yǎng)物質的消化與吸收:單寧和飼料中的營養(yǎng)物質,如蛋白質[28]、糖[29]、鈣[30]、銅和鋅[31]等結合成不溶于水的復合物。這些物質在動物消化道內比較穩(wěn)定,很難被消化。此外,單寧還能抑制消化酶活力,從而進一步降低營養(yǎng)物質的消化率。A l-M amary等[30]研究發(fā)現高粱單寧對兔消化酶具有顯著的抑制作用,飼料中3.5%單寧可分別抑制α-淀粉酶和脂肪酶活力達77%和43%。Kandra等[32]的研究也證實了單寧對唾液α-淀粉酶的抑制作用。單寧能降低營養(yǎng)物質的吸收。Kim和M iller[33]研究發(fā)現,茶水(含118 mg/l兒茶酚和82 mg/l單寧酸)能降低Sp rague-Dawley大鼠對鐵的吸收率達50%以上。該研究還指出,無論是外源(明膠)還是內源(唾液腺分泌)富脯氨酸蛋白均能提高Sp rague-Dawley大鼠對鐵的吸收率。富脯氨酸蛋白能提高鐵的吸收率的原因在于,其能取代鐵與單寧結合成不溶性的復合物,從而提高鐵的吸收率。

2)降低動物體內的氮平衡:研究表明,單寧能降低動物體內的氮平衡。King等[34]等用單寧含量不同的高粱飼喂北京鴨,發(fā)現高單寧含量的高粱可顯著降低其體氮沉積量。Narjisse等[23]研究發(fā)現橡樹(Quercus ilex)單寧可降低綿羊體氮保留率達159%。單寧降低氮平衡的原因可能是,降低氮的攝入量、消化吸收量以及提高氮的排出量。Narjisse等[23]研究發(fā)現,單寧能提高綿羊尿氮排出量達44%而對糞氮則沒有顯著影響。M arzo等[35]發(fā)現飼料中的單寧(25 g/kg飼料)顯著降低了雞的蛋白質效率同時顯著提高了雞肝臟的蛋白質降解率。Barahona等[36]研究發(fā)現單寧能夠提高綿羊糞氮排出量。單寧對糞氮的影響比較復雜,一方面,可能是單寧降低了氮的攝入量以及消化和吸收量;另一方面,單寧誘導唾液腺分泌的富脯氨酸蛋白也是造成體氮流失的重要原因。

3)改變動物消化道菌群:消化道菌群對動物、尤其是反芻動物的營養(yǎng)消化有重要作用[37]。Smith和Mackie[38]研究指出,縮合單寧改變了大鼠消化道微生物的種群結構,大鼠攝食含單寧的飼料后,其消化道中單寧耐受菌比例顯著上升。研究發(fā)現,縮合單寧對瘤胃蛋白質降解菌生長具有抑制作用并降低了該類細菌對蛋白質的水解率[37],因而也就降低了反芻動物對飼料蛋白質的消化率。

4)單寧能損害消化系統:單寧,尤其是高劑量的單寧,對動物消化系統的損害作用,已經在相關研究中得到驗證。Herv?s等[17]研究發(fā)現連續(xù)灌喂高劑量縮合單寧(3.0 g/kg體質量)10 d后綿羊胃腸道黏膜出現潰瘍、增厚,內部充氣膨脹以及充滿大量水樣物質。Marzo等[35]研究發(fā)現,單寧對雞肝臟的生長具有抑制作用。

1.3 單寧及其降解產物對養(yǎng)殖動物產生直接毒害作用

Boyd等[39]研究發(fā)現,單寧酸可對大鼠產生急性毒害作用?？诜螌幩岷?大鼠表現出驚厥呼吸衰竭并導致死亡,解剖結果顯示,單寧酸導致肝壞死、腎炎以及暫時性急性腸炎,并能導致脾、腎上腺皮質和睪丸等多個器官浮腫以及胸腺等萎縮。Glick和Joslyn[40]研究發(fā)現飼料中高濃度的單寧(8%)對剛斷奶的小鼠有致死作用,而隨著小鼠的生長,其對單寧的耐受能力逐漸增強。Saha和Kaviraj[13]研究了水解單寧和縮合單寧對羅非魚的急性和慢性毒性作用,發(fā)現縮合單寧對羅非魚的毒性作用大于水解單寧,96 h內水解單寧和縮合單寧對其半致死濃度(LC50)分別為107.2和55 mg/L。而Becker和M akkar[14]關于單寧對鯉影響的研究中得出了不同的結論,實驗結果顯示水解單寧對鯉的毒性顯著高于縮合單寧,當實驗進行至42 d時因水解單寧對實驗魚的毒害作用導致實驗無法繼續(xù)進行。Herv?s等[17]研究發(fā)現,灌喂綿羊高濃度單寧(3.0 g/kg體質量)5 d后其即表現出不良癥狀(體質虛弱,精神不振),8 d后綿羊呼吸和心跳速度加快,食欲減退,糞便黏稠表面覆蓋黏液,10 d后導致實驗無法繼續(xù)進行,而低濃度的單寧對綿羊未產生有害影響。動物種類的不同以及單寧的來源和組成差異可能是導致這些研究得出相悖結論的原因。單寧對養(yǎng)殖動物的毒性主要表現在兩個方面,一是直接損傷消化道,二是其代謝物質進入循環(huán)系統后對肝腎等造成損傷。

由于單寧具有較強的抗營養(yǎng)作用,因此,在動物飼料中應慎重添加富含單寧的植物性飼料原料。

2 單寧的去除方法

目前,已有大量關于去除植物性原料中單寧的方法報道。這對于提高植物性飼料原料、尤其是植物性蛋白源在飼料工業(yè)中的應用具有極其重要的意義。這些去除方法包括傳統的理化方法以及生物方法等。

2.1 理化方法

關于理化手段降解單寧的方法主要包括溶液浸提、干燥方式、脫殼、擠壓、堿、聚乙二醇以及射線處理等。

單寧往往存在于某些豆類的種皮內,而其他部位含量很少,因此通過脫殼可基本上完全除去其中的單寧[41]。擠壓過程中可以產生高溫,能對熱不穩(wěn)定的抗營養(yǎng)因子起到一定程度的破壞甚至是去除作用。Marzo等[42]研究指出,擠壓可以顯著降低蕓豆中包括縮合單寧和多酚類物質在內的多種抗營養(yǎng)因子含量。與未經處理的蕓豆相比,擠壓的蕓豆可顯著改善大鼠的生長性能。有研究表明,單寧對堿比較敏感,在堿性條件下,單寧活性受到抑制。Canbolat等[43]用不同濃度的NaOH溶液(0、20、40、60和80 g/L)分別對2種樹葉(A rbutus and rachne和Glycyrrhiza g labra L.)處理7 d,發(fā)現隨著NaOH溶液的升高,樣品中單寧含量直線下降,80 g/L NaOH溶液可分別降低A rbutus and rachne和Glycyrrhiza g labra L.60%和87%的單寧。草木灰被證明對單寧活性具有一定程度的抑制作用,由于草木灰水溶液呈堿性,因此,其作用機制被認為與NaOH相同。已有研究表明,草木灰不僅可以降低Acacia cyanophy lla中的單寧含量,還能提高綿羊對其蛋白質等的消化率[44]。由于單寧能與某些化合物結合成比與蛋白質等形成的復合物更難溶的復合物,因此向植物性原料中添加這類物質可顯著降低單寧的抗營養(yǎng)作用,這類物質包括,PEG和PRP,其中關于PEP以開展了大量研究。PEP能與單寧形成比蛋白質更難溶的復合物[45],因此能夠提高動物對含單寧飼料中蛋白質等的攝食率[46]、消化率[47]。Kim和M iller[33]研究發(fā)現PRP能夠改善Sp rague-Daw ley大鼠對鐵的吸收率。最新研究表明,射線處理對單寧具有明顯的去除作用。de Toledo等[48]用不同劑量的γ射線(2、4和8 kGy)照射5種不同的大豆,發(fā)現隨著放射劑量的增加,其包括單寧在內的多種抗營養(yǎng)因子含量顯著下降。

然而傳統方法往往在去除植物蛋白源中抗營養(yǎng)因子的同時,會降低其中其他營養(yǎng)物質的含量,導致原料的營養(yǎng)價值降低。Egounlety和Aworh[41]研究表明,用水對大豆、豇豆以及Macrotylom a geocarpa粉浸提12～14 h后,可降低其寡糖含量20%～30%,其中可降低蔗糖含量分別為27%、31%和35%。通過水浸提、脫殼、沖洗以及加熱綜合處理后,可降低上述3種豆粉中55%～74%的蔗糖。Marzo等[42]等研究發(fā)現,盡管擠壓沒有降低蕓豆中蛋白質、糖類、纖維和灰分含量,卻極顯著地降低了其中含硫氨基酸的含量。

2.2 微生物對單寧的降解作用

2.2.1 單寧對微生物的拮抗性 單寧被認為是植物在長期進化過程中為防止被動物采食和致病微生物感染而產生的一類具有防御作用的次級代謝物質[49]。因此,單寧具有抑制微生物生長以及抵抗生物降解的能力[50]。單寧對微生物的抑制機制目前尚未完全了解,其主要機制可能是:i與微生物的細胞壁上的某些物質反應,導致其功能降低或喪失;ii與微生物分泌的胞外酶結合使之活性喪失;iii與環(huán)境中的營養(yǎng)物質結合抑制微生物的吸收[51]。

2.2.2 單寧降解菌的種類與分布 盡管單寧有抑制微生物的功能,但仍有部分微生物被發(fā)現對可以在含有單寧的環(huán)境中穩(wěn)定地生長繁殖并能分泌單寧酶將單寧降解[7,51-52]。關于單寧降解菌的研究已有很長的歷史,據Knudson[53]報道,早在1867年,Van Tieghem就發(fā)現了1株青霉(Penicillium g laucum)能夠將五倍子中的單寧降解為沒食子酸。Bhat等[7]綜述了目前常見的單寧降解菌發(fā)現,具有單寧降解能力的微生物大多是霉菌,其中又以青霉屬(Penicillium)和曲霉屬(Aspergillus)種類居多,另外還有毛殼屬(Chaetomium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、絲核菌屬(Rhizoctonia)、柱孢屬(Cylind rocarpon)、木霉屬(Trichoderm a)的一些種類也有一定的降解單寧的能力。相對于霉菌,具有單寧降解能力的細菌種類相對較少,主要分布于芽孢桿菌屬(Bacillus)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)等。而關于具有單寧降解能力的酵母報道較少。最近的研究報告指出,某些乳酸菌(Lactobacilli)也具有降解單寧的的能力(見表2)。

表2 能降解單寧的微生物[7,55]Table 2 Tannin-degrading Microorganism s

單寧降解菌在自然界有著相當廣泛的分布。在單寧含量豐富的水體(如皮革廠排出的廢水等)、土壤、某些發(fā)酵食物以及攝食富含單寧飼料的動物消化道、糞便中,往往能較容易地分離出單寧降解菌。Kumar等[54]從制革廠的廢水中分離出1株能降解單寧的細菌(Citrobacter f reund ii),6 h內可產生單寧酶1.87 U/m L,并將單寧酸降解為葡萄糖和沒食子酸。M ahadevan和M uthukum ar[55]總結了以往研究報道的能夠在水體中分離到的微生物的種類,發(fā)現水體中分布的單寧降解菌以青霉屬(Penicillium)和曲霉屬(Aspergillus)種類居多。Osaw a等[56]從某些發(fā)酵的食品以及成年人的糞便中分離出了3株具有單寧降解能力的乳酸菌,而此前關于從發(fā)酵食品中分離單寧降解菌的研究尚未見報道。大量研究表明反芻動物消化道中具有單寧降解能力的微生物[57-59]。

2.2.3 單寧的微生物降解 目前已有大量關于微生物降解單寧的研究報道[7,55,57-59]。然而,利用微生物降解植物性原料中單寧的研究尚不多見。微生物不僅可以顯著降解植物性飼料原料中的單寧,還可以同時降解其他多種抗營養(yǎng)因子,并提高其營養(yǎng)物質含量,改善消化率。Gamble等[60]用3株白根霉(Ceriporiopsis subverm ispora CZ-3-8497、Ceriporiopsis subverm ispora FP-90031-sp和Cyathus stercoreus A TCC 36910)對Lespedeza cuneata進行發(fā)酵發(fā)現這3株白根霉均能顯著降低其單寧含量高達85%以上。Rakesh等[61]研究發(fā)現,霉菌發(fā)酵不僅顯著降低了刺槐(Robinia pseudoacacia)中單寧含量而且提高了粗蛋白含量,并顯著提高了其干物質消化率。Towo等[62]研究表明發(fā)酵可以顯著降低高粱中酚類物質和植酸鹽的含量,并能提高其鐵的體外消化率。

3 結論

單寧的抗營養(yǎng)作用主要體現在降低養(yǎng)殖動物的攝食率消化率以及對動物產生直接毒性等方面。盡管,目前以對單寧的抗營養(yǎng)作用開展了大量的研究,但是由于單寧的來源廣泛,種類眾多,組成復雜,因此不同的研究往往得出不同的甚至相反的結論。目前,大多數研究主要采用非純化的單寧(含單寧的飼料原料)進行實驗,但由于飼料原料中含有多種物質,往往可能對實驗結果產生不利影響,因此,采用純化單寧開展研究將具有更重要的意義。通過技術手段降低植物性飼料原料中單寧含量,以提高原料的利用率降低單寧對養(yǎng)殖動物的健康損害,具有重要的實際價值。盡管傳統方法能有效去除植物性原料中的單寧,但同時又造成了原料中其他營養(yǎng)成分的損失。與傳統的去除方法相比,微生物降解法具有更廣闊的前景。然而,目前關于微生物降解植物性飼料原料中單寧的研究較少,關于發(fā)酵產物對養(yǎng)殖動物(特別是水生動物)生長、存活等的影響更少。所以,開展微生物發(fā)酵降解植物性飼料原料中單寧的降解研究以及對養(yǎng)殖動物影響的研究將具有重要的理論與實際價值。

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