李偉文，陸松敏，方傳勤，劉建倉，郭素清，程 鳳，王正國

線粒體基因組與核基因組在遺傳信息表達(dá)上關(guān)系密切。調(diào)控線粒體基因表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1，PGC-1)通過與調(diào)節(jié)基因表達(dá)的結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子相互作用行使功能，調(diào)節(jié)核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1，NRF1)和NRF2等基因的表達(dá)，執(zhí)行特異的細(xì)胞程序，能誘導(dǎo)線粒體生物合成、呼吸和生熱作用［1］。PGC-1在適應(yīng)性產(chǎn)熱、線粒體生成等過程中有著重要作用［2］。國內(nèi)外文獻(xiàn)尚缺乏失血性休克時(shí)細(xì)胞PGC-1基因的表達(dá)變化規(guī)律的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察了PGC-1在失血性休克缺血缺氧條件下大鼠腸上皮細(xì)胞中表達(dá)的變化情況，以探討核轉(zhuǎn)錄因子對編碼呼吸鏈亞基的細(xì)胞核基因組和線粒體基因組表達(dá)的影響，揭示線粒體能量代謝障礙發(fā)生的原因。

材料與方法

1 采用轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測失血性休克大鼠腸上皮細(xì)胞核編碼基因PGC-1mRNA的表達(dá)變化

1.1 動(dòng)物模型的制作［3］健康Wistar大鼠，體重(250±20)g，由第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。將36只隨機(jī)等分為6組:(1)休克前組(對照組);(2)休克1小時(shí)組(HS 1小時(shí));(3)休克2小時(shí)組(HS 2小時(shí));(4)休克3小時(shí)組(HS 3小時(shí));(5)休克4小時(shí)組(HS 4小時(shí));(6)休克5小時(shí)組(HS 5小時(shí))。動(dòng)物快速放血(10分鐘內(nèi))使血壓降至 40mmHg(即5.32kPa)，休克1、2小時(shí)組分別維持1、2小時(shí);休克3、4、5 小時(shí)組均維持 2 小時(shí)后分別觀察 1、2、3 小時(shí)。休克前組處理同上，僅不放血。

1.2 核編碼基因PGC-1mRNA水平的檢測 于以上各時(shí)相剖腹取小腸制備腸上皮細(xì)胞［4］，參照文獻(xiàn)［5］提取腸上皮細(xì)胞RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳。100V，5分鐘;50V，55分鐘后觀察并拍照。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。RT-PCR采用TaKaRa RNA PCR kit(AMV)寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。PGC-1引物

1A(bp 1945)5’-CGCAGAGAGTATGAGAAGCG-3’，

1B(bp 2179) 5’-AAGCGTCACAGGTGTAACGG-3’擴(kuò)增長度 235bp β-actin引物

5’-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGTAAAG-3’5’-CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATGGAGG-3’擴(kuò)增長度275bp

2 采用Western-blot法檢測腸上皮細(xì)胞PGC-1蛋白的表達(dá)變化

2.1 主要試劑 一抗:兔抗小鼠PGC-1單克隆抗體(美國，Chemicon公司)，二抗:辣根過氧化酶(HPR)標(biāo)記的羊抗兔IgG(美國，Chemicon公司)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中山公司)，抗體稀釋液(北京中山公司)，低分子量蛋白Marker(上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)公司):14.4KD～97.4KD，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(NENTMlife science)，麗春紅S(Sigma)，牛血清白蛋白(Roche)，細(xì)胞總蛋白裂解液(Pierce)。

2.2 細(xì)胞總蛋白提取 細(xì)胞1×107個(gè)，加入200μl冰預(yù)冷的總蛋白提取液，冰浴中勻漿，4℃裂解30分鐘，4℃ 12 000g離心10分鐘，保留上清液，即為全細(xì)胞總蛋白。Bradford法測定蛋白含量后，分裝并于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 Western免疫印跡(Westernblot) 取60μg蛋白，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將PVDF膜放入封閉液［Tris緩沖鹽溶液(TBS)配制的5% 脫脂奶粉中］4℃封閉4小時(shí)，TBS液漂洗后加1:100稀釋的一抗，37℃孵育2小時(shí)。TBS洗膜后加1:1000稀釋的二抗，37℃孵育1小時(shí)。按DAB顯色試劑盒使用說明操作，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法顯色，暗室顯影、定影后觀察結(jié)果。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析 利用數(shù)字化凝膠分析儀分析得出各條帶面積光強(qiáng)度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)確定組間差別，P＜0.05為差別顯著，P＜0.01為差別非常顯著。

結(jié) 果

1 失血性休克大鼠腸上皮細(xì)胞PGC-1mRNA水平的變化

本實(shí)驗(yàn)中PGC-1、β-actinmRNA PCR產(chǎn)物分別為235bp和275bp。對照組和所有休克組RNA提取以及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳加樣量都是相同的，這樣就排除了因加樣量不同而造成假陽性和假陰性。

正常情況下，腸上皮細(xì)胞核編碼基因PGC-1 mRNA有較低程度表達(dá)，失血性休克1小時(shí)大鼠腸上皮細(xì)胞PGC-1 mRNA表達(dá)開始增加，2小時(shí)達(dá)高峰并維持到3小時(shí)，后又開始減弱，到休克晚期5小時(shí)PGC-1mRNA表達(dá)顯著弱于休克前(P＜0.05)(見表1、圖1)。

2 失血性休克腸上皮細(xì)胞PGC-1蛋白的表達(dá)

Western-blot結(jié)果顯示，正常大鼠腸上皮細(xì)胞PGC-1蛋白含量較低。失血性休克1小時(shí)大鼠腸上皮細(xì)胞PGC-1蛋白含量基本沒有變化。失血性休克2小時(shí)，即休克中期PGC-1蛋白表達(dá)增強(qiáng)，后又漸減弱，失血性休克5小時(shí)已明顯弱于休克前，結(jié)果見表2、圖2。

表1 失血性休克大鼠腸上皮細(xì)胞核編碼基因PGC-1mRNA的表達(dá)變化(n=6，光強(qiáng)度比值，±s)

表1 失血性休克大鼠腸上皮細(xì)胞核編碼基因PGC-1mRNA的表達(dá)變化(n=6，光強(qiáng)度比值，±s)

與正常對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 對照組HS1h HS2h HS3h HS4h HS5h PGC-1/β-actin0.4634±0.0631 0.703±0.0965*0.7746±0.0896＊＊0.7585±0.0865＊＊ 0.5586±0.0466 0.3082±0.0585*

表2 失血性休克大鼠腸上皮細(xì)胞核編碼基因PGC-1蛋白的表達(dá)變化(n=3，光強(qiáng)度值，±s)

表2 失血性休克大鼠腸上皮細(xì)胞核編碼基因PGC-1蛋白的表達(dá)變化(n=3，光強(qiáng)度值，±s)

與正常對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 對照組HS1h HS2h HS3h HS4h HS5h PGC-1蛋白 0.7642±0.0313 0.7538±0.0475 0.8943±0.0496＊＊0.8848±0.0585＊＊ 0.7589±0.0425 0.6764±0.0475*

圖1 失血性休克大鼠腸上皮細(xì)胞PGC-1基因mRNA的改變

圖2 失血性休克腸上皮細(xì)胞線粒體PGC-1蛋白雜交結(jié)果

討 論

PGC-1能結(jié)合多種轉(zhuǎn)錄因子增強(qiáng)靶基因轉(zhuǎn)錄效率，參與多種代謝通路的調(diào)節(jié)活動(dòng)［6］。PGC-1異常表達(dá)可引起與線粒體生理功能及能量代謝相關(guān)的細(xì)胞反應(yīng)。在棕色脂肪、肌肉和心肌中，傳遞能量需求的信號可使PGC-1表達(dá)增高，PGC-1的過度表達(dá)刺激線粒體的生物合成。認(rèn)識這種多功能輔激活因子在失血性休克時(shí)缺血缺氧所致?lián)p傷細(xì)胞中表達(dá)變化情況具有重要意義。

1 PGC-1生理作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制

PGC-1是染色體4p15.1區(qū)域的基因編碼的一種核受體刺激因子。人類PGC-1開放讀碼框(openreading frame，ORF)包含2 394個(gè)核苷酸，編碼798個(gè)氨基酸，分子量91kDa。大鼠的PGC-1氨基酸序列與人類有95%的一致性，與小鼠有98%的一致性，分別與人類和小鼠的PGC-1有1個(gè)和2個(gè)N端氨基酸缺失的差異。人類、大鼠和小鼠PGC-1的功能基序大多是高度保守一致的［7］。PGC-1的 N末端轉(zhuǎn)錄活性區(qū)，是與幾種轉(zhuǎn)錄因子相互作用的區(qū)域，命名為AD1和AD2;C末端與處理新轉(zhuǎn)錄的RNA有關(guān)。PGC-1上還有 NRF等的結(jié)合位點(diǎn)。PGC-1通過直接的蛋白-蛋白相互作用方式輔激活轉(zhuǎn)錄因子［7］，能參與對染色質(zhì)的修飾，與RNA聚合酶Ⅱ復(fù)合體相互作用，對mRNA加工，結(jié)合其他輔激活因子等，還能與TRAP/Mediator復(fù)合體相互作用［8］。PGC-1α 能被 p38 MAPK 激活。p38 MAPK對PGC-1的正調(diào)節(jié)作用機(jī)制是通過解除p160MBP與PGC-1的負(fù)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而消除其負(fù)調(diào)節(jié)作用［9］。

2 失血性休克大鼠缺血缺氧腸上皮細(xì)胞輔激活因子PGC-1表達(dá)的改變及意義

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在失血性休克時(shí)，大鼠腸上皮細(xì)胞中PGC-1 mRNA表達(dá)在休克早期表達(dá)開始增強(qiáng)，2小時(shí)和3小時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，后又漸減弱，至休克5小時(shí)時(shí)其表達(dá)明顯低于休克前水平。有報(bào)道高濃度過氧化氫可促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞PGC-1 mRNA表達(dá)，該過程與腺苷酸激酶(AMP kinase)激活有關(guān)［10］。說明缺血缺氧早期可上調(diào)PGC-1 mRNA，可能與氧自由基生成增多有關(guān)。PGC-1 mRNA的上調(diào)，可以使PGC-1蛋白合成增多，為PGC-1功能增強(qiáng)創(chuàng)造條件，以便適應(yīng)細(xì)胞能量供應(yīng)不足時(shí)線粒體加強(qiáng)能量代謝的過程，刺激線粒體的生物合成。而休克失代償期細(xì)胞內(nèi)與基因表達(dá)有關(guān)的能量和原料供應(yīng)均減少，擾亂了PGC-1在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，從而下調(diào)了PGC-1 mRNA的表達(dá)，繼而使PGC-1輔激活轉(zhuǎn)錄因子的能力減弱，相對抑制了編碼呼吸鏈亞基的細(xì)胞核基因組和線粒體基因組的表達(dá)，更加重了線粒體的能量代謝障礙。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠失血性休克2小時(shí)腸上皮細(xì)胞PGC-1蛋白表達(dá)量有所增高，后開始下降，到休克晚期5小時(shí)時(shí)，與正常對照組相比，其蛋白含量非常顯著降低(P＜0.01)。說明在休克早期，PGC-1 mRNA的上調(diào)，能使PGC-1蛋白合成增多，從而誘導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)能量代謝需要基因的表達(dá)，并加強(qiáng)了線粒體能量代謝的過程。隨著休克的發(fā)展，PGC-1 mRNA表達(dá)下降，PGC-1蛋白合成減少，輔激活轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)能力減弱，細(xì)胞能量生成障礙，細(xì)胞及其線粒體損傷更趨嚴(yán)重。推測如能阻止PGC-1蛋白表達(dá)的下降，可能會(huì)減輕休克時(shí)細(xì)胞及其線粒體的損傷。Srivastava等［11］研究證實(shí)，通過誘導(dǎo)PGC-1α/β表達(dá)，可以部分彌補(bǔ)線粒體疾病患者存在的細(xì)胞呼吸鏈功能的缺陷，增加線粒體生物合成。國內(nèi)陳淑娟等［12］實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明，增加PGC-1α在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，可以增加線粒體生物合成，反之，可降低線粒體生物合成。目前，PGC-1在調(diào)控通路中的作用的更多研究正在深入進(jìn)行，而有關(guān)失血性休克缺血缺氧條件下PGC-1基因表達(dá)的調(diào)控研究將無疑具有一定的臨床應(yīng)用前景。

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