楊翠云,夏傳海,劉蘇靜,周世偉 (中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所,山東 煙臺(tái) 264003)

海洋生物污損是指海洋微生物、植物和動(dòng)物附著在海洋人工設(shè)施上造成的危害.藻類(lèi)是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的重要初級(jí)生產(chǎn)者,是形成污損生物的基礎(chǔ).此外,近年來(lái)頻繁暴發(fā)的赤潮的起因也往往與藻類(lèi)增殖密切相關(guān).三角褐指藻即是一種常見(jiàn)的赤潮藻類(lèi),為保證海洋生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展,開(kāi)發(fā)具有抑制微藻生長(zhǎng)的防污劑勢(shì)在必行.

異噻唑啉酮類(lèi)化合物是指含有異噻唑啉酮環(huán)的系列化合物的總稱(chēng),是一種較新的有機(jī)除藻劑. 其對(duì)真菌、細(xì)菌、藻類(lèi)均有較強(qiáng)的殺滅性,具低毒、高效和在水中易降解的特點(diǎn)[1-2].被廣泛應(yīng)用于殺菌、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、海洋防污等領(lǐng)域[3-5].值得關(guān)注的是,該類(lèi)化合物對(duì)于海洋赤潮的防治也有明顯效果[6-7].基于此,作者選取三角褐指藻為模式藻種,研究異噻唑啉酮類(lèi)化合物 BIT(1,2-苯并異噻唑啉-3-酮)及其類(lèi)似物 X(N-丙?；?1,2-苯并異噻唑啉-3-酮)對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)的抑制效應(yīng),比較其對(duì)藻類(lèi)的抗污效果,以期為防污劑的研制開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用藻株三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)來(lái)自中國(guó)科學(xué)院海洋研究所. 海水取自天然海水,經(jīng)脫脂棉過(guò)濾后,再用 0.45μm 醋酸纖維濾膜過(guò)濾,121℃高溫高壓滅菌20min后用作藻類(lèi)培養(yǎng).在三角玻璃瓶中,添加 f/2配方的營(yíng)養(yǎng)鹽,光照強(qiáng)度 50μE/(m2?s),光暗比(L/D)=12h/12h,溫度(20±1)℃條件下在恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)瓶每天定時(shí)搖動(dòng)1次,防止貼壁生長(zhǎng).BIT(1,2-苯并異噻唑啉-3-酮)及其類(lèi)似物 X(N-丙?；?1,2-苯并異噻唑啉酮-3-酮),純度均達(dá)到95%以上,可用于一般的毒理學(xué)試驗(yàn).

1.2 方法

1.2.1 抑藻試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的三角褐指藻接種于 100mL 三角瓶中,使藻密度為1×105～2×105個(gè)/mL,加入BIT,使其終濃度分別為:0,0.5,1,1.5,2,2.5,3.0mg/L,每處理設(shè)3個(gè)平行.對(duì)X設(shè)同樣濃度處理,每處理設(shè)3個(gè)平行.每天取樣顯微鏡下計(jì)數(shù)藻細(xì)胞密度,并根據(jù)藻細(xì)胞密度計(jì)算藻細(xì)胞比生長(zhǎng)速率,以及取樣第2d和第4d的藻細(xì)胞密度比,并選取產(chǎn)生最大抑制效應(yīng)的第4d的藻細(xì)胞密度比,進(jìn)行 Logistic 曲線方程擬合,計(jì)算BIT和X的EC50值.每2d取樣測(cè)定藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素及類(lèi)胡蘿卜素含量.

1.2.2 藻細(xì)胞密度、細(xì)胞比生長(zhǎng)速率、細(xì)胞密度比計(jì)算 藻細(xì)胞密度計(jì)數(shù)：每天定時(shí)取出1mL均勻的培養(yǎng)液,用 5%甲醛固定,并在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)藻細(xì)胞數(shù)量的變化.平行計(jì)數(shù)3～5 次,取平均值.

藻細(xì)胞比生長(zhǎng)速率計(jì)算:根據(jù)藻細(xì)胞密度,依照公式 (1) 計(jì)算藻細(xì)胞比生長(zhǎng)速率[8].

式中:μ為比生長(zhǎng)速率,d-1;Nt1為藻細(xì)胞在 t1時(shí)刻的密度;Nt2為藻細(xì)胞在t2時(shí)刻的密度;△t為2次測(cè)定之間的時(shí)間間隔,d.藻細(xì)胞密度比計(jì)算:根據(jù)每天取樣計(jì)數(shù)的藻細(xì)胞密度計(jì)算.藻細(xì)胞密度比=處理組藻細(xì)胞密度/空白組藻細(xì)胞密度.

1.2.3 葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量測(cè)定 每2d取5mL藻液 4000r/min離心 5min,棄去上清液,用95%的乙醇重新懸浮沉淀,并于 4℃冰箱提取葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素.24h后,4000r/min離心5min,取上清液在紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-1810,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)上,于波長(zhǎng)665,649,470nm 處測(cè)上清液的吸光度.根據(jù)Lichtenthaler和Buschmann提出的公式計(jì)算葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量[8]:

式中: A為吸光值(波長(zhǎng)665, 649, 470nm處), Chla為葉綠素a.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)采用origin 7.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析,P＜0.01表示差異極顯著.應(yīng)用 SigmaPlot for Windows Version 10.0(Systat Software Inc., USA)進(jìn)行曲線方程擬合及EC50的計(jì)算.

2 結(jié)果與討論

2.1 BIT及其類(lèi)似物X對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)的影響

由圖1可見(jiàn),2mg/L和3mg/L BIT處理對(duì)三角褐指藻具有明顯的抑制作用,且在生長(zhǎng)第4d,抑制率顯著,分別為51.29%、84.76%.而0.5mg/L和1mg/LBIT處理下,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與對(duì)照無(wú)明顯差別,說(shuō)明低濃度BIT對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)基本沒(méi)有影響.2mg/L和3mg/L的X處理對(duì)三角褐指藻具有一定的抑制作用,最明顯的抑制率發(fā)生在生長(zhǎng)第3d,分別為36.24%、45.01%.相同濃度處理下X沒(méi)有BIT 的抑制作用明顯,低濃度的X處理同樣對(duì)三角褐指藻的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的抑制作用.但無(wú)論是低濃度處理組還是高濃度處理組,藻細(xì)胞密度均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加.總體來(lái)看,BIT或X的處理只是延長(zhǎng)了藻細(xì)胞的延滯生長(zhǎng)期,且處理濃度越高,效果越明顯;但隨著時(shí)間的延長(zhǎng),這種作用也越來(lái)越弱,處理組和對(duì)照組,藻細(xì)胞生長(zhǎng)曲線均呈逐漸上升的趨勢(shì),這與文獻(xiàn)報(bào)道的很多外源性物質(zhì)對(duì)藻類(lèi)的脅迫作用相似[9-11].研究表明,鼠李糖等表面活性劑或殺藻劑對(duì)多種海洋藻類(lèi)包括中肋骨條藻、新月菱形藻、旋鏈角毛藻等具有一定的抑制效應(yīng),但隨著處理時(shí)間延長(zhǎng),處理組藻細(xì)胞密度均呈快速增值趨勢(shì),藻細(xì)胞生長(zhǎng)的延滯期長(zhǎng)短取決于外源性物質(zhì)的濃度高低.本實(shí)驗(yàn)中同時(shí)發(fā)現(xiàn),在高濃度BIT處理下,最初培養(yǎng)液中會(huì)出現(xiàn)白色沉淀,顯微鏡觀察推測(cè)可能是藻細(xì)胞死亡的殘?bào)w,未死亡的藻細(xì)胞經(jīng)過(guò)一段時(shí)間適應(yīng)之后逐漸增殖,使其度過(guò)外源性化合物的脅迫期,呈現(xiàn)從被動(dòng)適應(yīng)到主動(dòng)適應(yīng)的過(guò)程.

圖1 不同濃度BIT和X處理對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of BIT and X on the growth of Phaeodactylum tricornutum

細(xì)胞比生長(zhǎng)速率與藻細(xì)胞密度比可以進(jìn)一步評(píng)價(jià)外源性物質(zhì)對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響.從圖2可以看出,3mg/L的BIT處理組,藻細(xì)胞比生長(zhǎng)速率顯著低于對(duì)照組(P＜0.01),說(shuō)明高濃度 BIT處理能顯著抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng);2mg/L的BIT處理,藻細(xì)胞比生長(zhǎng)速率略微低于對(duì)照,但經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)沒(méi)有達(dá)到顯著水平;而低濃度(0.5,1mg/L)BIT處理,細(xì)胞比生長(zhǎng)速率與對(duì)照幾乎沒(méi)有差異.同樣,X的低濃度處理組(0.5,1mg/L)細(xì)胞比生長(zhǎng)速率和對(duì)照也無(wú)明顯差異,而高濃度X處理組(2,3mg/L),細(xì)胞比生長(zhǎng)速率低于對(duì)照,說(shuō)明高濃度的X處理能夠抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng),但這種抑制作用沒(méi)有達(dá)到顯著水平.

圖2 不同濃度BIT和X處理對(duì)三角褐指藻細(xì)胞比生長(zhǎng)速率的影響Fig.2 Effects of BIT and X on the specific growth rate of Phaeodactylum tricornutum

同樣,選取第2d和第4d的藻細(xì)胞密度比來(lái)評(píng)價(jià)BIT和X對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)的抑制效應(yīng),圖3可以看出,隨著B(niǎo)IT處理濃度的增加,培養(yǎng)第2d和第4d的藻細(xì)胞密度比明顯降低,并且在3mg/L的處理濃度下,第4d的藻細(xì)胞密度比顯著低于第2d的藻細(xì)胞密度比,說(shuō)明高濃度的BIT能顯著抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng). X對(duì)三角褐指藻的處理第2d和第4d的藻細(xì)胞密度比同樣隨處理濃度的升高而顯著下降(P＜0.01),但第2d和第4d相比藻細(xì)胞密度比沒(méi)有顯著差異,說(shuō)明高濃度X的處理沒(méi)有隨時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)出對(duì)三角褐指藻有更明顯的抑制效應(yīng).藻細(xì)胞密度比對(duì)BIT和X的響應(yīng)正好和藻細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率相對(duì)應(yīng),高濃度的BIT顯著抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)而X對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一定的抑制效應(yīng)但均沒(méi)有達(dá)到顯著水平.

圖3 不同濃度BIT和X處理對(duì)三角褐指藻細(xì)胞密度比的影響Fig.3 Effects of BIT and X on the cell density ratio of Phaeodactylum tricornutum

選取最大抑制(接種4d)時(shí)的樣品,探討 BIT和X對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)的抑制效應(yīng).以對(duì)照中三角褐指藻密度為100%,計(jì)算各提取液處理下三角褐指藻相對(duì)密度,得到提取液對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)的抑制曲線(圖4).運(yùn)用Logistic曲線方程擬合,即可獲得BIT和X的96h半效應(yīng)質(zhì)量濃度(EC50)分別為1.95mg/L(R2=0.988, P=0.0013)和3.26mg/L(R2=0.908, P=0.0279). EC50值的差異進(jìn)一步證實(shí)BIT對(duì)三角褐指藻的抑制作用比X對(duì)藻的抑制作用強(qiáng).除本實(shí)驗(yàn)研究的三角褐指藻之外,國(guó)內(nèi)江濤等[12]研究也發(fā)現(xiàn),異噻唑啉酮對(duì)湛江球形棕囊藻、海洋單細(xì)胞藻和棕櫚藻均有較強(qiáng)的殺滅作用.而Willingham 等[13]指出,異噻唑啉酮類(lèi)似物 Sea-Nine211防污劑對(duì)Enteromorpha藻和硅藻 Amphora coffeaeformis具有較強(qiáng)的殺滅作用,半數(shù)致死量LD50分別為0.002mg/L和0.003mg/L,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于本研究的EC50值,這可能是由于外源性化合物對(duì)藻類(lèi)的脅迫效應(yīng)具有種類(lèi)特異性[9],并且和實(shí)驗(yàn)初期藻細(xì)胞起始密度具有一定關(guān)系.Hong等[14]曾報(bào)道,EMA(2-甲基-乙酰乙酸乙酯)對(duì)綠藻 Selenastrum capricornutum的生長(zhǎng)、生理脅迫反應(yīng)和藻細(xì)胞的初始密度密切相關(guān).同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在其他文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道中,藻類(lèi)的起始密度或藻類(lèi)的不同生長(zhǎng)期加入外源性物質(zhì),藻類(lèi)受到的脅迫反應(yīng)大小不同,或者說(shuō)恢復(fù)正常生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)期的時(shí)間不同.

圖4 不同濃度BIT和X處理對(duì)三角褐指藻的抑制效應(yīng)Fig.4 Inhibitory effect of BIT and X on Phaeodactylum tricornutum

2.2 BIT及其類(lèi)似物X對(duì)三角褐指藻細(xì)胞色素含量的影響

藻細(xì)胞色素含量是藻類(lèi)生長(zhǎng)特征的表征參數(shù),是藻生物量的一種反映,同時(shí)也是藻進(jìn)行生長(zhǎng)光合作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ),色素含量可以反映藻類(lèi)生長(zhǎng)狀況和藻類(lèi)的光合作用利用效率[17].由圖5可見(jiàn),三角褐指藻生長(zhǎng) 3d時(shí),低濃度0.5mg/L的BIT對(duì)藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量均沒(méi)有明顯影響;而1mg/L的BIT處理3d顯著降低了細(xì)胞內(nèi)葉綠素含量(P＜0.01)和類(lèi)胡蘿卜素含量(P＜0.05),分別降低了 21.85%和21.09%;高濃度 BIT(2mg/L 和3mg/L)處理 3d,細(xì)胞內(nèi)葉綠素分別降低53.09%、88.91%,類(lèi)胡蘿卜素含量分別降低54.42%、90.02%,均達(dá)到極顯著水平(P＜0.01).藻細(xì)胞經(jīng)過(guò)處理7d時(shí),只有3mg/L的BIT處理組細(xì)胞內(nèi)葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量顯著低于對(duì)照(P＜0.05),分別降低53.8%、58.71%,而其他處理組和對(duì)照相比均沒(méi)有明顯變化,說(shuō)明隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)BIT引起的藻細(xì)胞的脅迫效應(yīng)逐漸減弱,這和藻細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線結(jié)果類(lèi)似.隨著時(shí)間的延長(zhǎng),藻細(xì)胞生長(zhǎng)密度逐漸增加,恢復(fù)生長(zhǎng).而X對(duì)藻細(xì)胞內(nèi)色素含量的影響只有在高濃度3mg/L處理7d時(shí)細(xì)胞內(nèi)葉綠素含量降低30.51% (P＜0.01),而類(lèi)胡蘿卜色素含量在處理3d、7d時(shí)均顯著降低,分別降低 51.18%、31.04%.BIT和X對(duì)藻細(xì)胞內(nèi)色素含量的影響結(jié)果顯示,異噻唑啉酮類(lèi)化合物能夠抑制藻細(xì)胞內(nèi)色素含量,進(jìn)而影響藻細(xì)胞的光合作用效率,影響藻的生長(zhǎng).以前的研究報(bào)道表明,外源性物質(zhì)對(duì)藻的抑制機(jī)理主要在4個(gè)方面:破壞藻細(xì)胞結(jié)構(gòu),改變?cè)宓墓夂?、呼吸以及?xì)胞內(nèi)酶的活性.Yang等[16]報(bào)道外源性物質(zhì)EMA能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)一系列酶和非酶物質(zhì)的改變抵抗外界脅迫,并發(fā)現(xiàn) EMA能抑制細(xì)胞內(nèi)色素含量,改變色素比例,這可能是藻類(lèi)適應(yīng)逆境脅迫的策略.在本研究中,發(fā)現(xiàn)BIT和X能夠抑制藻細(xì)胞的色素含量,說(shuō)明其光合作用受到抑制,但隨處理時(shí)間延長(zhǎng),抑制作用減弱.這說(shuō)明:藻細(xì)胞數(shù)量的增加抵抗了脅迫,這和外源性物質(zhì)對(duì)藻的抑制效應(yīng)隨細(xì)胞起始密度增加而減弱相呼應(yīng)[14,18].

圖5 不同濃度BIT和X處理對(duì)三角褐指藻細(xì)胞色素含量的影響Fig.5 Effects of BIT and X on the pigment contents of Phaeodactylum tricornutum

細(xì)胞色素含量的增加提高了藻的光合作用,而外源性物質(zhì)的濃度只可能不變或減少,因此藻細(xì)胞逐漸適應(yīng)并抵抗了外界脅迫.本研究同時(shí)確認(rèn), BIT比X具有更好的抑藻效果,具有更低的EC50值,在海洋防污劑開(kāi)發(fā)中有更好的的應(yīng)用前景.但在實(shí)際應(yīng)用中,還應(yīng)該考慮其在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化及其可能存在的生態(tài)安全性,防止類(lèi)似于四丁基錫(TBT)類(lèi)防污劑廣泛應(yīng)用后帶來(lái)的生態(tài)災(zāi)害問(wèn)題發(fā)生,關(guān)于BIT對(duì)其它污損生物的防污效果及其環(huán)境歸宿還需要更進(jìn)一步深入系統(tǒng)研究.

3 結(jié)論

3.1 異噻唑啉酮類(lèi)化合物對(duì)三角褐指藻的生長(zhǎng)、比生長(zhǎng)速率、細(xì)胞密度比結(jié)果均顯示,BIT和X在高濃度下對(duì)三角褐指藻均具有一定的抑制效應(yīng),能增加藻細(xì)胞生長(zhǎng)的延滯期,但這種抑制作用均會(huì)隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱,藻細(xì)胞逐漸恢復(fù)快速增殖,BIT的抑制效應(yīng)優(yōu)于X.

3.2 BIT和X能夠降低三角褐指藻細(xì)胞內(nèi)色素含量,BIT在處理3d時(shí),較低濃度(1mg/L,2mg/L)和高濃度(3mg/L)均能降低細(xì)胞內(nèi)葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量,但處理7d時(shí)只有高濃度能夠降低色素含量,而X在整個(gè)處理時(shí)間內(nèi)只有高濃度能夠降低細(xì)胞色素含量.

3.3 BIT和X對(duì)藻的96h半效應(yīng)質(zhì)量濃度(EC50)分別為1.95mg/L(R2=0.988,P=0.0013)和3.26mg/L(R2=0.908, P=0.0279),EC50值的差異進(jìn)一步說(shuō)明BIT比X對(duì)三角褐指藻的抑制作用強(qiáng).

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