楊開杰

(邢臺廣播電視大學理工系,河北邢臺 054000)

蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白分離純化新方法研究

楊開杰

(邢臺廣播電視大學理工系,河北邢臺 054000)

分離蘇云金芽孢桿菌(Bt)晶體蛋白常用的方法有液體雙相法、密度梯度法、沉淀法、生物-物理分離法等,但這幾種方法各有優(yōu)缺點。從分離成本、儀器設(shè)備、純度、產(chǎn)量、活性等方面考慮,在超聲波處理、懸液制備和紫外線輻射3個方面進行了改進,提出了一種新的分離Bt晶體蛋白的方法,產(chǎn)品純度可達90%以上,產(chǎn)率從原來的20%提高到28%。本方法成本低,產(chǎn)率高,操作簡單,具有很強的實用價值。

蘇云金芽孢桿菌;分離純化;晶體蛋白

蘇云金芽孢桿菌(bacillus thuringiensis,Bt)是一種綠色生物農(nóng)藥,屬于微生物殺蟲劑,其有效殺蟲成分是伴孢晶體和芽孢。由于Bt具有對病蟲害防治效果好、對人畜安全無毒、不污染環(huán)境、不殺害天敵等優(yōu)良品質(zhì)而倍受青睞,全世界年產(chǎn)值已突破1億美元,并且以每年10%～20%的速度上升[1]。為了更深刻地了解Bt農(nóng)藥的殺蟲機理及其基因表達,從Bt中分離純化有效成分伴孢晶體則十分重要[2]。目前常用的分離純化方法有雙相法、密度梯度法、沉淀法、生物-物理分離法,這些方法在晶體蛋白的質(zhì)量和產(chǎn)量、實驗的重復性等方面各有優(yōu)缺點。常用的四氯化碳-硫酸鈉雙相法盡管產(chǎn)量比較高,所用試劑價廉,儀器簡單,但純度不夠,試劑毒性比較大,操作不方便。密度梯度法常用的是泛影葡胺梯度離心法,能獲得純度較高的晶體,但產(chǎn)量較低,試劑及實驗條件要求比較嚴格。沉淀法試劑便宜,產(chǎn)品純度高,但操作繁瑣,產(chǎn)率低。生物-物理分離法試劑昂貴,實驗條件苛刻,產(chǎn)率低[3]。在前人工作的基礎(chǔ)上,筆者對超聲波處理條件、離心條件、試劑選擇等方面進行了改進,建立了一種新的Bt伴孢晶體分離純化方法,收到了比較理想的效果。

1 材料、設(shè)備與方法

1.1 材料和設(shè)備

材料:Bt,中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心提供;牛肉膏,胰蛋白胨,酵母膏,葡萄糖,瓊脂,磷酸氫二鈉,北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠提供;聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100),中國醫(yī)藥(集團)上海化學試劑公司提供;溴化鈉,天津化學試劑三廠提供;小菜蛾,購自中國科學院動物所,在培養(yǎng)箱中于25℃養(yǎng)育繁殖。

主要設(shè)備:數(shù)顯光照培養(yǎng)箱,磁力攪拌器,座式電熱壓力蒸汽消毒器,SW-CJ-FD型凈化工作臺,YS2-H生物顯微鏡,SIGMA離心機,J Y92型超聲波細胞粉碎機,L GJ臺式冷凍干燥機。

1.2 方 法

1.2.1 菌體的固體培養(yǎng)

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的組成如下:牛肉膏3 g,蛋白胨 10 g,氯化鈉 5 g,瓊脂 15～20 g,去離子水1 000 mL,pH值為7.4～7.6。使用此培養(yǎng)基,進行斜面活化接種,在培養(yǎng)箱中于37℃固體培養(yǎng)24 h獲得Bt菌株。

1.2.2 菌體的液體培養(yǎng)

液體種子培養(yǎng)基的組成如下:胰蛋白胨質(zhì)量分數(shù)為0.5%,酵母膏質(zhì)量分數(shù)為0.5%,葡萄糖質(zhì)量分數(shù)為0.1%,磷酸氫二鈉質(zhì)量分數(shù)為0.08%,去離子水500 mL。滅菌前用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0。將固體培養(yǎng)基所得到的Bt菌株用無菌水制成一級種子,接種到液體種子培養(yǎng)基中,在恒溫光照培養(yǎng)箱中以250 r/min的轉(zhuǎn)速于30℃培養(yǎng)16 h,獲得Bt發(fā)酵液。

1.2.3 晶體的提純與分離

將培養(yǎng)成熟的Bt發(fā)酵液用磁力攪拌器攪拌。孢子的密度較小,大部分進入泡沫,而蛋白晶體處于水層。除去泡沫,使孢子和晶體得到初步分離,再經(jīng)多次重復以盡量除去孢子。然后用超聲波處理,使芽孢、晶體以及碎片在水中均勻分散。在4℃冰箱內(nèi)放置24 h,使芽孢和伴孢晶體充分游離。于7 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min,棄去上層清液。加蒸餾水制成懸浮液,離心洗滌3次,然后用0.5 mol/L的NaCl溶液洗滌2次,收集沉淀物。將得到的沉淀物用生理鹽水制成孢晶懸液,放入4℃冰箱備用,每次制成水懸液都經(jīng)超聲波處理。

將孢晶懸液離心分離,使沉淀懸浮于0.4 mol/L的NaCl+質(zhì)量分數(shù)為0.01%的 Triton X-100(二者體積比為1︰1)的溶液中,在4℃的冰箱里靜置過夜。離心分離,收集沉淀物,制成水懸液。配制濃度不同(2.8,3.2,3.6 mol/L)的溴化鈉溶液,將水懸液放在溴化鈉溶液中,于7 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心分離15 min即在2.8 mol/L和3.6 mol/L的界面處得到伴孢晶體層,用彎頭注射器沿壁插入,收集含有晶體的溴化鈉溶液。將得到的溴化鈉溶液于7 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心分離10 min,收集晶體沉淀,用蒸餾水洗滌沉淀3～4次,配制成晶體水懸液,并置入冰箱冷凍過夜后,放入冷凍干燥機中干燥,得到白色的晶體蛋白。用此方法獲得的晶體純度可達99%以上,產(chǎn)率為28%。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲波條件的選擇

為了將Bt的孢子囊和伴孢晶體分離開,通常使用的手段是進行超聲波處理,文獻中介紹的一般方法是間隔時間為0.1 s,超聲時間為1 s,超聲次數(shù)為50次,目測分離效果。超聲時間過短,分離效果差;超聲時間過長,容易破壞伴孢晶體。為了更準確選定超聲條件,使用顯微鏡代替人眼進行觀察。發(fā)現(xiàn)在上述條件下仍有部分孢子囊和伴孢晶體沒有分開,超聲強度還有加大的空間。因此,調(diào)整了超聲條件,使用顯微鏡進行觀察,既保證孢子囊和伴孢晶體的良好分離,又不破壞伴孢晶體。最終選定的優(yōu)化條件如下:間隔時間為0.1 s,超聲時間為2 s,超聲次數(shù)為90次。

2.2 水懸液制備方法的改進

在洗滌過程中,傳統(tǒng)方法是在離心后將溶液直接制成水懸液,不能使晶體蛋白分散均勻。本實驗采用增加質(zhì)量分數(shù)為0.01%的 Triton X-100的用量,加超聲波處理(處理條件:間隔時間為0.1 s,超聲時間為1 s,超聲次數(shù)為20次),使晶體蛋白在懸浮劑中均勻分散。傳統(tǒng)的液體雙相分離法純度不夠,本實驗在液體雙相分離前對水懸液作進一步處理,在很大程度上提高了晶體蛋白的純度和產(chǎn)率。

2.3 紫外線輻射條件的改進

傳統(tǒng)方法中,經(jīng)常使用紫外線來處理半成品以避免細菌滋生,但是紫外線具有破壞伴孢晶體的特性。為了證實這一點進行了對照實驗,用小菜蛾測定伴孢晶體的活性。研究發(fā)現(xiàn),輻射10 min,毒力效價從80 000 IU/mg降到了30 000 IU/mg,這說明用紫外線照射半成品會嚴重降低伴孢晶體的活性。因此,不用紫外線輻射來殺菌,而采用在無菌操作臺操作,收到了很好的效果。

2.4 分離晶體的純度鑒定

本實驗采用涂片鏡檢,采用革蘭氏染色法計算出晶體的純度。對提純后的晶體進行染色鏡檢,選擇10個視野,計算平均值。采用此方法求得產(chǎn)品的純度在90%以上。同時采用電子掃描電鏡進行觀察,放大6 000倍在電鏡下可清晰地觀察到菱形或矩形的伴孢晶體。

2.5 產(chǎn)品毒力效價的測定

伴孢晶體的毒力效價是衡量其活性的一個重要指標,采用國家標準浸液飼喂法進行毒力測定,用已配制好的不同濃度的標準樣品和產(chǎn)品懸浮液浸泡定量的蓮花白菜葉。供饑餓24 h的三齡初小菜蛾飼食,48 h后檢查小菜蛾的死亡情況,結(jié)果見表1。

表1 產(chǎn)品毒力效價的測定結(jié)果Tab.1 Testing result on toxicity efficiency of product

將測定質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換成對數(shù)值,將校正死亡率轉(zhuǎn)換成死亡幾率值,進行直線擬合,得到標準品和產(chǎn)品的回歸方程、半數(shù)致死量L C50值及其毒力效價。標準品的回歸方程為y=3.231 7+1.362 1x,相關(guān)系數(shù)為0.919,半數(shù)致死量為19.871 mg/L。樣品的回歸方程為y=5.300 6+1.569 6x,相關(guān)系數(shù)為0.960,半數(shù)致死量為0.643 mg/L。由此求得樣品的毒力效價為556 264.4 IU/mg。由表1可以得出,樣品和標準品的回歸相關(guān)系數(shù)均不低于0.919,說明稀釋質(zhì)量濃度對數(shù)值與死亡幾率值呈現(xiàn)高度相關(guān),制劑質(zhì)量濃度與測定昆蟲死亡關(guān)系密切,測定結(jié)果比較可靠有效,產(chǎn)率從原來的 20%提高到了28%。同時,校正死亡率及幾率值隨質(zhì)量濃度的降低而遞減,能夠達到檢測要求。從測定的結(jié)果看,此方法分離所得到產(chǎn)品的毒力效價遠遠高于傳統(tǒng)方法得到產(chǎn)品的毒力效價。

3 結(jié) 語

1)通過顯微鏡觀察深入研究了超聲波分離伴孢晶體的條件,認為間隔時間為0.1 s,超聲時間為2 s,超聲次數(shù)為90次是比較優(yōu)化的條件。

2)通過大量的實驗佐證,認為對半成品進行紫外線輻射滅菌將嚴重影響產(chǎn)品的活性,提出采用無菌操作臺來完成操作,省去了紫外線輻射步驟,使產(chǎn)品活性大大提高。

3)改進了懸浮液溶劑,提高了蛋白的分散均勻性。產(chǎn)品經(jīng)染色鏡檢純度在90%以上,電鏡觀察晶型良好,毒力效價測試為556 264.4 IU/mg,產(chǎn)率從原來的20%提高到了28%。本方法成本低,產(chǎn)率高,操作簡單,應用前景廣闊。

[1]趙新民,黃 凡,付祖姣,等.殺線蟲蘇云金芽孢桿菌研究進展[J].農(nóng)藥,2007,46(5):296-299.

[2]劉金環(huán),薛 靜,宋富平.蘇云金芽孢桿菌BtC008殺蟲晶體蛋白基因鑒定、克隆及殺蟲活性分析[J].植物保護,2006,32(6):22-26.

[3]李海濤,王洪成,劉志洋.Bt殺蟲晶體蛋白的研究概述[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學,2004(5):37-39.

Isolation and purification of protein crystal from Bt

YANG Kai-jie
(Polytechnic Department,Xingtai University of Broadcast and Television,Xingtai Hebei 054000,China)

There are many methods such as liquid double phase,density gradient,sediment,bio-physics separation and so on,frequently used to isolate and purify the protein crystal from bacillus thuringiensis(Bt).However,these methods have their own defects as well as advantages.In this paper,the isolation cost,the equipment,the purity,the output and the activity were considered.Three improvements on ultrasonic wave process,suspension liquid preparation and ultraviolet ray radiation were made.Thus,a new method to separate crystal protein from Bt was set up.This technology has a characteristic of low cost,simple operation and high application.The production ratio is improved from 20%to 28%with the product purity of 90%.

bacillus thuringiensis(Bt);isolation and purification;protein crystal

Q939

A

1008-1534(2011)04-0254-03

2010-07-07;

2011-03-29

責任編輯:張士瑩

楊開杰(1964-),男,河北邢臺人,講師,主要從事生物農(nóng)藥方面的研究。