金利容，萬鵬，黃民松，黃薇，楊紹麗，喻大昭

（湖北省農業(yè)科學院植保土肥研究所，湖北 武漢430064）

棉花變黑輪枝菌的鑒定及致病性的測定

金利容，萬鵬，黃民松，黃薇，楊紹麗，喻大昭

（湖北省農業(yè)科學院植保土肥研究所，湖北 武漢430064）

自湖北棉區(qū)有黃萎病癥狀的棉葉中分離到能產生厚垣孢子的褐色菌，取2個供試菌株V12和V24，經形態(tài)特征、生物學特性和ITS分析，鑒定為變黑輪枝菌（V.nigrescens）.對其致病性進行測定，發(fā)現其對棉花致病力極弱.推測該菌是一種植物衰老期或植物生長勢呈下降趨勢時的病原菌，常與大麗輪枝菌混生.

變黑輪枝菌；鑒定；致病性

1816年Nees von Esenbeck［1］建立了Verticillium屬，主要包括大麗輪枝菌（V.dahliaeKleb.）、黑白輪枝菌（V.albo－atrumReinke et Berth.）、變黑輪枝菌（V.nigrescensPethyhr.）、云狀輪枝菌（V.nubiliumPethybr.）和三體輪枝菌（V.tricorpusIsaac）.引起棉花黃萎病主要為大麗輪枝菌（V.dahliaeKleb.）.Pethybridge首次從英國馬鈴薯植株和塊莖中分離到兩種產生厚垣孢子的輪枝菌［2］，分別命名為變黑輪枝菌（V.nigrescensPethyhr.）和云狀輪枝菌（V.nubiliumPethyhr.）.1969年 Phillips從有褐莖腐病的大豆植株中分離到變黑輪枝菌［3］.據報道，變黑輪枝菌是棉花的弱致病菌，可使棉花輕度萎蔫發(fā)黃［4－6］.本研究室在湖北棉區(qū)分離到能產生厚垣孢子的褐色菌，經形態(tài)特征、生物學特性和ITS分析結果鑒定為變黑輪枝菌.

1 材料和方法

1.1 菌株的采集、分離和純化供試樣本采集于湖北棉區(qū)，菌株分離于有黃萎病癥狀的棉葉葉柄.本試驗共采用6個菌株，2個供試菌株：V12－1和 V24－1，由本實驗室分離得到；2個變黑輪枝菌（V.nigrescens）對照菌株：V394和V43，由西北農林科技大學胡小平老師提供，從苜蓿中分離得到；2個大麗輪枝菌（V.dahliae）對照菌株：V11和V991，V11由本實驗室分離得到，V991由華中農業(yè)大學張獻龍老師提供.

分離采用組織保濕培養(yǎng)法，將棉株葉柄用自來水洗凈，用0.1%升汞處理30s，后用滅菌水清洗數次后用剪刀剪成小段，放在滅菌的玻片上保濕，25℃下恒溫培養(yǎng)，大約7d后在顯微鏡下觀察兩端是否有輪枝小梗，將其挑出并進行純化，單孢分離.

1.2 菌株的形態(tài)學鑒定將供試菌株和對照菌株接種于PDA平板上于25℃暗培養(yǎng)1周后進行菌落觀察和鏡檢.挑取菌塊的少許，置于顯微鏡下觀察并用測微尺測量分生孢子和厚垣孢子的大小.將菌落用小刀切開，12～24h后觀察分生孢子梗的形態(tài).

將各菌株接種于查氏液體培養(yǎng)基，放入25℃恒溫搖床上150r／min培養(yǎng)7d，觀察液態(tài)培養(yǎng)特性.

1.3 溫度對菌落生長的影響供試溫度：設置15、20、25、30、33、35℃ 共5個溫度.試驗方法：用直徑為0.6cm的打孔器切取菌餅接種于PDA固體培養(yǎng)基上，分別置于上述6個不同溫度的恒溫箱內暗培養(yǎng)，設3個重復.觀察和記錄持續(xù)2周，第14天測量菌落直徑，用十字交叉平均法算出各菌株菌落的直徑.

1.4 菌株DNA的提取和核糖體ITS基因擴增與測序

1.4.1 菌株DNA的提取 采用CTAB法［7］提取6個菌的菌株DNA.DNA電泳檢測.

1.4.2 ITS擴增 用真核生物核糖體DNA通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增.其序列為，ITS1：5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′，ITS4：5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′.

PCR反應體系總體積為50μL，反應液組分為：10×PCR Buffer 5μL，25mmol／L MgCl24μL，10 mmol／L dNTP 2μL，5U／μL Taq酶0.3μL，模板DNA 10ng，引物ITS1和ITS4（25μmol／L）各1μL，加ddH2O使總體積達到50μL，在PTC－100PCR擴增儀上擴增.擴增條件：95℃預變性4min；94℃變性1min；54℃退火1min；72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min.PCR產物委托南京金斯瑞生物公司進行純化和測序.

1.4.3 ITS序列分析 將6個菌株的核糖體DNA－ITS序列用DNAMAN軟件進行同源性分析，并將這些菌株的測序序列與GenBank中已經注冊的核酸數據庫中的ITS序列進行同源性比較（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／blast），建立同源關系圖.

1.5 致病性測定

1.5.1 棉株的準備 準備無土基質若干，于滅菌鍋中滅菌2h，滅菌后攤開晾干.將感病品種鄂棉24脫絨處理，取大約300粒棉種種入無土基質中，待棉株長至1～2片真葉時待接種.

1.5.2 菌液的準備 活化4個菌株V991、V11、V12－1和V24－1，在PDA上長至4d后在邊緣挑取少許菌絲接種于查氏培養(yǎng)基中，放入25℃恒溫搖床上150r／min培養(yǎng)7d，用滅菌四層紗布過濾，用無菌水將孢子液濃度調整到1×107個／mL.

1.5.3 接種方法 待棉株長至1～2片真葉時將棉株從疏松的基質中慢慢托起，以免傷到幼苗，從中選230株健康的棉苗，在4個不同菌株的菌液里各浸入50株苗子接種，接種時間為30min.其中30株浸到無菌水中，作為空白對照.接種30min后將棉苗重新種入到基質中.將環(huán)境溫度控制在22～27℃，每2d澆一次水，保證苗子的濕度.每天觀察和記錄病害的發(fā)生情況，第15天、第20天、第25天和第30天調查發(fā)病率及病情指數.以第30天調查的結果記錄發(fā)病情況并計算發(fā)病指數.

2 結果與分析

2.1 菌株形態(tài)學特征

2.1.1 菌落形態(tài) 各菌株固體培養(yǎng)基的形態(tài)：V12－1、V24－1和V43在PDA平板上培養(yǎng)初期為白色，1周左右后顏色開始慢慢變成褐色或者黑褐色，在菌落表面產生灰白色粉層，并有小顆粒狀的菌絲團形成，邊緣整齊光滑.V394與前三者形態(tài)上一致，只是顏色要略深一點，為深褐色.V11和V991在PDA平板上培養(yǎng)初期為白色，后變?yōu)楹谏?，產生黑色微菌核，邊緣整齊，上面形成一層較薄的白色圈.

各菌株液體培養(yǎng)基的形態(tài)：V12－1、V24－1、V394和V43液體培養(yǎng)7d后在瓶壁上出現一圈淺紅色或者淺褐色的菌絲體，菌液中產生白色顆粒狀的菌絲團，鏡檢發(fā)現其產孢量較大.V11和V991液體培養(yǎng)7d后在瓶壁上會出現一層微菌核形成的黑色圈，菌液渾濁，未出現白色顆粒狀的菌絲團.

2.1.2 分生孢子梗的形態(tài) 6個菌株均能在切開的菌落邊緣產生大量形態(tài)一致的輪枝孢子梗，輪枝孢子梗的形態(tài)并無太大的差異，均能形成層次分明的輪枝，3～5層互生、對生或者輪生，多的可達8～10層，分生孢子有的位于輪枝孢子梗的頂端，呈圓形.有的散落出來，呈橢圓形，如圖1A.

從老菌落中挑取顏色較深的部分在顯微鏡下觀察發(fā)現，供試菌株和V.nigrescens菌能產生厚垣孢子，這種厚垣孢子呈圓形、梨形、卵形或者不規(guī)則形，由細小菌絲聯接而成.位于基絲末端或中部，單生或幾個排列成短鏈，如圖1B.

圖1 顯微鏡觀測圖像（A：輪枝分生孢子，10×10倍；B：厚垣孢子，10×40倍）

用測微尺對各菌株的分生孢子和厚垣孢子的大小進行測定，V11和V991不能產生厚垣孢子，其分生孢子略大些，兩個供試菌株和兩個V.nigrescens菌株能產生厚垣孢子，兩個供試菌株的厚垣孢子略大于兩個V.nigrescens菌，見表1.

2.2 溫度對各菌株生長的影響溫度試驗表明，2個供試菌株和2個V.nigrescens菌在15～30℃在PDA上均能較好地生長，33℃下生長緩慢，在35℃仍略有生長，最適生長溫度約為25～28℃.兩個V.dahliae菌35℃停止生長，最適生長溫度約為23～25℃.對6個菌各個處理溫度的生長速率進行統(tǒng)計學分析表明，6個菌在各個溫度處理下的生長速度有一定的差異，同樣的溫度下兩個V.dahliae菌與其他4個菌有較為顯著的差異，見表2.

表1 各菌株分生孢子和厚垣孢子的大小

表2 不同溫度下生長14d后6個菌株的菌落直徑 cm

圖2 V11在不同溫度下的菌落形態(tài)（C：菌落背面，D：菌落正面）

2.3 ITS分析結果利用真核生物核糖體DNA通用引物ITS1和ITS4對這6個菌株的ITS區(qū)進行PCR擴增，均得到約為500bp的片段，將擴增產物送南京金斯瑞公司純化測序，將測序結果放到GenBank上查找，發(fā)現供試菌株和兩個V.nigrescens菌與已注冊的V.nigrescens有較高的同源性，而V11和V991則與已注冊的V.dahliae有較高的同源性.我們選取已注冊的V.nigrescensCBS 179.40 （GenBank No.EF543851）和V.dahliaeT9（GenBank No.AY555947）ITS序列，用DNAMAN軟件進行同源性比對，建立同源關系圖.結果表明，T9、V991和V11有100%的同源性，V12－1、V24－1、V43、V394和CBS有100%的同源性.結合形態(tài)學特征，判斷本實驗室分離的2株供試菌株為變黑輪枝菌（圖4）.

2.4 致病性測定結果對2個供試菌和兩個V.dahliae菌進行致病性測定，結果發(fā)現，2個供試菌株接種于棉花上并不表現有明顯的黃萎病癥狀，植株生長正常，不受抑制，僅有個別植株出現萎蔫；而V991和V11的第30天調查的病指分別為72.2和52.5，表現出較為明顯的黃萎病癥狀.

圖3 V24－1在不同溫度下的菌落形態(tài)（E：菌落背面，F：菌落正面）

3 討論

關于從棉花中分離到變黑輪枝菌，國內的報道并不多見，陳吉棣在北京的茄子、馬鈴薯、利馬豆、菜豆、豇豆、茼麻、藜、葎草，黑龍江的茄子和河北的馬鈴薯等植物上首次分離到變黑輪枝菌［9］.王克榮等在我國江蘇省棉區(qū)分離到3個V.nigrescens菌株［10］.本研究室從湖北棉區(qū)采集的黃萎病病株中分離到能產生厚垣孢子的褐色輪枝菌，選取其中兩株，并結合兩個V.nigrescens菌和兩個V.dahliae菌，進行形態(tài)學、生物學特性及ITS序列分析，鑒定為變黑輪枝菌（V.nigrescens）.這是首次報道從湖北棉區(qū)分離到變黑輪枝菌.

從菌落形態(tài)上看，兩個供試菌株V12－1和V24－1的菌落顏色為褐色，其休眠結構并不是黑色的微菌核，而是菌絲聯接在一起的厚垣孢子，商鴻生等認為菌絲休眠體的形態(tài)是區(qū)分各近似種的重要形態(tài)鑒別特征［11］.V12－1和 V24－1的分生孢子的大小與兩個V.nigrescens菌的大小相當，但略小于兩個V.dahliae菌.而兩個供試菌株厚垣孢子的大小比兩個V.nigrescens菌要大些，據報道，不同地區(qū)分離的V.nigrescens菌的分生孢子和厚垣孢子的大小數值并不是完全一致［12－14］.在溫度試驗中，V12－1、V24－1和兩個V.nigrescens菌33℃生長良好，35℃邊緣仍有少許生長，而兩個V.dahliae菌35℃不生長.將ITS擴增序列用軟件進行同源性比對，V12－1和V24－1的ITS序列與V.nigrescens同源性很高，達到100%.

致病性測定結果表明，V12－1和V24－1對棉花的致病性很弱，且對植株生長影響也不大，這與王克榮等的結果是一致的.V12－1和V24－1是9月初從典型的黃萎病棉株中分離得到的，陳吉棣［9］指出，主要在植物后期分離到變黑輪枝菌，大多與大麗輪枝菌混生.我們可以認為該菌是一種植物衰老期或植物生長勢呈下降趨勢時的病原菌，由于其通常與大麗輪枝菌混生，較難分離到.雖然V12－1和V24－1對苗期棉花不具致病力或致病力極弱，但是否會對棉花后期造成影響，還需要進一步的研究.

圖4 同源關系圖

［1］Nees von Esenbeck C G.Das system der pilze und schwamme［M］.Ein bersuch，Würzburg：In der Stahelschen buchhandlung，1816.

［2］Pethybridge G H.Notes on some saprophytic species of fungi associated with diseased potato plants and tubers［J］.Trans Brit Mycol Soc，1919，6：104－120.

［3］Phillips D V.Incidence of brown stem rot of soybean in Georgia［J］.Plant Dis，1970，54：987－988.

［4］Roncadori R W.Fungal invasion of developing cotton bolls［J］.Phytopathology，1969，59：1356－1359.

［5］Wiese M V，DeVay J E，Ravenscroft A V.Relationship between polygalacturonase activity and cultural characteristics ofVerticilliumisolates pathogenic in cotton［J］.Phytopathology，1970，60：641－646.

［6］Wyllie T D，DeVay J E.Growth characteristics of several isolates ofVerticilliumalbo－atrumandVerticillium nigrescensfrom cotton［J］.Phytopathology，1970，60：907－910.

［7］Tayor J W，Natvig D O.Isolation of fungal DNA［M］.Personal Communication，1998.

［8］CMI descriptions of pathogenic fungi and bacteria［M］.Kew，Surrey，England：Commonwealth Mycological Institute，1970：257－258.

［9］陳吉棣.變黑輪枝菌—我國寄主植物上首次報道的一種輪枝菌［J］.植物病理學報，1982，12（1）：33－37.

［10］王克榮，陸家云.變黑輪枝菌種的鑒定及其致病力的測定［J］.南京農業(yè)大學學報，1987，1（2）：59－62.

［11］商鴻生，楊家榮，趙小明.苜蓿黃萎病菌與輪枝孢屬近似種的比較研究［J］.草業(yè)學報，1998，7（4）：32－37.

［12］Devaux A L，Sackston W E.Taxonomy ofVerticilliumspecies causing wilt of horticultural crops in Quebec［J］.Canad Jour Bot，1966，44（6）：803－811.

［13］Hoes J A.Development of chlamydospores inVerticilliumnigrescensandV.nubilum［J］.Canad Jour Bot，1971，49：1863－1866.

［14］Isaac I A.A comparative study of pathogenic isolates ofVerticillium［J］.Brit Mycol Soc Trans，1949，32：137－157.

Indentification and pathogenicity determination of isolates ofVerticilliumnigrescensPethybr

JIN Lirong，WAN Peng，HUANG Minsong，HUANG Wei，YANG Shaoli，YU Dazhao
（Institute of Plant Protection and Soil Science，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

V12and V24，two isolates ofVerticilliumwith brown chlamydospores，isolated from cotton growing regions in Hubei，were identified asVerticilliumnigrescensbased on morphology，biological characters and ITS analysis.Inoculating cotton in greenhouse，we found that the pathogenicity of both the two isolates was very weak to cotton.It was speculated that the isolates were a kind of pathogen parasitizing on the stage of plant senescence，or plant in downward trend.And it was often mixed withV.dahliae.

VerticilliumnigrescensPethybr；indentification；pathogenicity

S435

A

1000－2375（2011）04－0413－05

2011－03－30

農業(yè)部公益性行業(yè)科研專項（nyhyzx07－052）和國家科技基礎性工作專項（SB2007FY027）資助

金利容（1982－），女，助理研究員；喻大昭，通信作者，研究員，E－mail：dazhaoyu＠china.com

（責任編輯 游?。?/p>