韋平和，彭加平，周錫樑

(常州工程職業(yè)技術學院 江蘇省應用酶工程技術研究開發(fā)中心，江蘇 常州 213164)

膜技術在酶法生產L-色氨酸中去除蛋白質和色素的應用研究

韋平和，彭加平，周錫樑

(常州工程職業(yè)技術學院 江蘇省應用酶工程技術研究開發(fā)中心，江蘇 常州 213164)

目的 用超濾-納濾膜分離法去除L-色氨酸酶法轉化液中的蛋白質和色素。方法 L-色氨酸轉化液經適當處理后，輸入超濾膜和納濾膜設備，分別收集輸出的清液和濃液，然后檢測其透光率并用加入堿或乙醇方式，檢查轉化液中蛋白質、色素的去除效果。結果 在轉化液pH調節(jié)至5.5～6.0、溫度控制在20～25℃的膜分離工藝條件下，經超濾-納濾輸出的清液，加入堿或乙醇無蛋白質析出，透光率達85%以上，比使用活性炭脫色處理的濾液高2.7倍。結論 膜分離法去除轉化液中蛋白質和色素的效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的絮凝劑沉淀蛋白質和活性炭脫除色素，從而為酶法生產L-色氨酸提供了一條綠色、先進的純化工藝。

膜分離;L-色氨酸;超濾;納濾;蛋白質;色素

目前，L-色氨酸的生產方法主要是發(fā)酵法和酶法，發(fā)酵法是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉價原料為碳源，利用谷氨酸棒桿菌、枯草桿菌等L-色氨酸產生菌，經微生物細胞內的復雜代謝而生成L-色氨酸;酶法主要是利用色氨酸酶，經酶促反應將底物L-絲氨酸(L-半胱氨酸或丙酮酸)和吲哚合成 L-色氨酸［1］。酶法以其終產物積累量高、反應周期短以及與環(huán)境友好等優(yōu)點而為人們所重視，Terasawa等［2］以高表達的E.coli色氨酸酶催化L-絲氨酸和吲哚合成L-色氨酸;韋平和等［3-4］采用自主構建的色氨酸酶基因工程菌WW-4，分別催化L-絲氨酸和吲哚、L-半胱氨酸和吲哚合成 L-色氨酸;龐敏等［5］用 E.coli色氨酸酶催化DL-絲氨酸和吲哚合成L-色氨酸;李鑫等［6］以色氨酸酶和絲氨酸羥甲基轉移酶雙酶催化甘氨酸、甲醛和吲哚合成L-色氨酸。但是，上述酶法合成途徑形成的L-色氨酸轉化液，與發(fā)酵法形成的發(fā)酵液一樣，同樣含有菌體、蛋白質和色素等雜質，影響L-色氨酸的提取和純化，有效去除這些雜質，則是提高L-色氨酸回收率和產品質量的關鍵。

發(fā)酵液或轉化液中菌體、蛋白質和色素等雜質的去除方法主要有離心、絮凝、活性炭脫色和膜分離等方法，其中膜分離法是將膜技術應用于物料分離、濃縮、提純的一項新技術，具有在常溫下進行、無相態(tài)變化、節(jié)能和環(huán)保等特點，近年來已在各個工業(yè)領域及科學研究中廣泛應用。本文以酶法合成的并經陶瓷膜去除菌體的L-色氨酸轉化液為對象，研究了采用超濾膜、納濾膜分離技術去除L-色氨酸轉化液中蛋白質和色素的工藝條件，試圖為酶法生產L-色氨酸提供一條綠色、先進的純化工藝。

1 材料

L-色氨酸轉化液:以本室構建的色氨酸酶基因工程菌WW-4，按文獻［4］將底物L-半胱氨酸和吲哚經酶促反應制備獲得。

L-半胱氨酸購自上?？颠_氨基酸廠;吲哚購自上海潤捷化學試劑有限公司;乙醇、氫氧化鈉為分析純;硫酸鎂及其它試劑均為國產化學純。

UV-7502PCS紫外可見分光光度計(上海精密儀器儀表有限公司);PHS-3B型精密酸度計(上海雷磁儀器廠);SenLong 30 L雙層玻璃反應釜(北京世紀森朗實驗儀器有限公司)。

陶瓷膜(國產0.2～80μm濾管)設備、超濾膜(國產UF-16011W2膜)設備、納濾膜(美國海德能ESNA1-LF膜)設備，均為浙江湖州富優(yōu)得膜分離科技有限公司產品。

2 方法

2.1 轉化液預處理

取L-色氨酸轉化液20 L，輸入陶瓷膜設備，去除菌體，分別收集清液和濃液，濃液再加入適量純水洗滌，繼續(xù)收集清液至原轉化液體積。

2.2 絮凝與超濾去除轉化液中的蛋白質

2.2.1 絮凝 將經預處理的轉化液升溫至70℃，調整 pH 8.5 ～9.0，加入 0.4% 硫酸鎂作絮凝劑，沉淀去除蛋白質，過濾后檢測濾液的透光率及檢查蛋白質去除效果。

2.2.2 超濾 將經預處理的轉化液調整pH 4.2～6.5，在壓力0.18 ～0.24 mPa下輸入超濾膜設備超濾，分別收集輸出的清液和濃液，然后檢測清液和濃液的透光率，檢查蛋白質去除效果。

2.3 二次絮凝并活性炭與超濾-納濾去除轉化液中的色素和蛋白質

2.3.1 二次絮凝并活性炭 將經預處理的濾液升溫至75 ～80 ℃，調整 pH 4.5 ～5.0，加入0.2%硫酸鎂和1%活性炭，沉淀去除蛋白質和脫除色素，過濾后檢測濾液的透光率，檢查色素脫除及蛋白質去除效果。

2.3.2 超濾-納濾 將2.2.2項下的清液在壓力0.6～1.0 mPa下輸入納濾膜設備，分別收集清液和濃液，然后檢測其透光率，檢查色素脫除和蛋白質去除效果。

2.4 透光率的測定

取待檢液約20 mL，調節(jié)溫度20℃后，取適量置10 mm比色杯，于460 nm波長處測量相對于水的透光率。

2.5 蛋白質的檢查

2.5.1 方法1 取待檢液約25 mL，調節(jié)溫度20℃后，滴入4 mol/L氫氧化鈉溶液，調整 pH 9.0～10.0，振搖3 min，靜置10 min，觀察是否產生白色絮狀物。

2.5.2 方法2 取待檢液約25 mL，調節(jié)溫度20℃后，加入無水乙醇3 mL，振搖3 min，靜置10 min，觀察是否產生白色絮狀物。

3 結果

3.1 超濾去除轉化液中蛋白質的效果

結果見表1～2。超濾膜法去除L-色氨酸轉化液中蛋白質的效果遠遠優(yōu)于絮凝法。轉化液經超濾膜分離后的清液檢查蛋白質，只出現微量的絮狀物;而絮凝法處理后的濾后轉化液，仍能檢出大量蛋白質存在。

3.2 超濾-納濾去除轉化液中色素及蛋白質的效果

結果見表3～4。L-色氨酸轉化液經超濾再進行納濾膜分離后的清液透光率可達85%以上，比使用活性炭脫色處理后的濾液高約2.7倍，說明納濾膜分離法比活性炭脫色法對轉化液中的色素脫除更為有效。超濾-納濾膜分離后的清液，未檢出蛋白質絮狀物，而用絮凝法雖經二次加入硫酸鎂沉淀蛋白質，仍檢查出有蛋白質的白色絮狀物。

3.3 轉化液pH對超濾-納濾去除蛋白質和膜通量的影響

L-色氨酸轉化液pH對膜分離過程去除蛋白質的效果有一定影響，在放大實驗時發(fā)現轉化液在pH 5.0以下的蛋白質去除效果不如在pH 5.0以上的。在pH 5.0以下的膜分離清液中，加入乙醇可略見白色絮狀物，透光率也明顯偏低，而pH 5.0以上的膜分離清液中無白色絮狀物出現，透光率可達85%以上，結果如圖1。

表1 硫酸鎂去除轉化液中蛋白質的效果Tab.1 The efficiency of removing proteins from the conversion solution with magnesium sulfate

表2 超濾去除轉化液中蛋白質的效果Tab.2 The efficiency of removing proteins from the conversion solution with UF

表3 硫酸鎂并活性炭去除轉化液中色素及蛋白質的效果Tab.3 The efficiency of removing pigments and proteins from the conversion solution with magnesium sulfate and activated carbon

表4 超濾-納濾去除轉化液中色素及蛋白質的效果Tab.4 The efficiency of removing pigments and proteins from the conversion solution with UF combined with NF

圖1 不同pH轉化液對經超濾-納濾后清液透光率的影響Fig.1 Effect of different pH values of conversion solution on transmittance of the clear filtrate after UF-NF membrane filtration

由圖1可知，轉化液pH對蛋白質的去除效果在pH 6.5為好，但在放大實驗時又發(fā)現pH 6.5的轉化液在膜分離過程中膜通量下降較快。選擇pH 5.2，5.7和6.5三種不同 pH 值的L-色氨酸轉化液，分別檢測其在膜分離過程中膜通量的變化，結果見圖2。pH 5.2的轉化液在濾過時對選用的ESNA1-LF膜的Zeta電位無太大改變，因此對膜通量影響不大，而pH 6.5的轉化液有可能改變了膜的Zeta電位，使膜通量受影響。因此，采用超濾-納濾膜法去除L-色氨酸轉化液中的蛋白質，綜合考慮多方面的影響，轉化液的pH值應調至5.5～6.0較為合適。

圖2 三種pH轉化液對納濾過程中膜通量的影響Fig.2 Effect of three kinds of pH value of conversion solution on permeate flux in the NF process

3.4 轉化液溫度在膜分離過程中對膜通量的影響

轉化液溫度在膜分離過程中對膜通量的影響較大，放大實驗時直接應用經陶瓷膜去除菌體的L-色氨酸轉化液進行超濾和納濾，開始溫度約30℃，膜通量90 L/(m2·h)，1 h后溫度升至45℃，膜通量僅40 L/(m2·h)。為考察合適的溫度，本研究比較了在10，20，25，30，35 和 40 ℃ 條件下分離 pH 5.8轉化液100 L的膜通量變化，結果見圖3。在20℃以下膜通量沒有什么變化，35℃以上膜通量在30 min后迅速下降。因此，應用膜法去除L-色氨酸轉化液中的蛋白質和色素，轉化液的溫度控制在20～25℃較為合適。

圖3 不同溫度轉化液對納濾過程中膜通量的影響Fig.3 Effect of different temperatures of conversion solution on permeate flux in the NF process

4 討論

研究結果表明，膜分離法對L-色氨酸轉化液的蛋白質去除效果遠遠優(yōu)于絮凝法，究其原因是轉化液經相對分子質量(Mr)7 000超濾膜和Mr500納濾膜分離后，Mr大于500的蛋白質及蛋白質碎片已被截留在濃液中，而絮凝劑是很難將Mr為幾百的蛋白質碎片全部凝聚的，活性白土也不可能將全部凝聚的蛋白質吸附，故經絮凝法處理后的濾后轉化液仍殘留較多的蛋白質。傳統(tǒng)的活性炭脫色法并不能把色素全部脫除，經脫色后的濾液透光率只有30%左右，而Mr500的納濾膜則能將小分子色素截留在濃液中，故經納濾后的清液透光率能達到85%以上。目前納濾膜的型號較多，本文未涉及對納濾膜選型的討論，但研究結果表明用于L-色氨酸轉化液的色素脫除，選用ESNA1-LF納濾膜是正確的。

L-色氨酸轉化液在pH 5.0以下的蛋白質去除效果不如在pH 5.0以上，這可能與轉化液中的主要蛋白——色氨酸酶的pI有關。韋平和等［7］報道重組E.coli色氨酸酶合成反應的最適pH為7.0，龐敏等［8］認為 E.coli色氨酸酶在 pH 5.5 ～7.5 范圍內較穩(wěn)定，Suzuki等［9］發(fā)現 Symbiobacterium thermophilum耐高溫色氨酸酶的pI為4.9，據此推測本文所選用的重組E.coli色氨酸酶，其pI值應該明顯高于5.0。在轉化液pH為4.2和4.5等明顯低于色氨酸酶pI值(5.0以上)時，色氨酸酶蛋白帶正電荷而影響其凝聚，從而影響超濾-納濾去除L-色氨酸轉化液中蛋白質碎片的效果。另外，轉化液 pH在4.2和4.5等較低情況下，膜的Zeta電位較低，易引起納濾膜對蛋白質碎片截留率的下降，也在一定程度上影響轉化液中蛋白質的去除效果。

轉化液溫度在20℃以下膜通量沒有什么變化，35℃以上膜通量在30 min后迅速下降。這一結果與其它應用膜技術分離氨基酸方面的報道不同［10-11］，究其原因，這些研究者處理的是發(fā)酵液，菌體沒有破碎，游離蛋白質不多，在較高溫度下有利于溶液黏度下降和擴散系數增大，所以可提高膜通量。然而，酶法生產L-色氨酸需應用菌體破碎后游離出的色氨酸酶作為催化劑，并將底物轉化為L-色氨酸，因此溶液體系有很大差別。酶法合成的轉化液在經陶瓷膜去除破碎的菌體后，溶液中仍含有大量的游離蛋白質及其碎片。張立卿等［12］認為膜具有柔韌性，當溫度升高時膜膨脹使得膜孔徑增大，造成膜吸附增加，而膜孔徑增大又易引起膜孔窄化和膜孔堵塞。L-色氨酸轉化液中的各種蛋白質特別是色氨酸酶，在較高溫度下容易發(fā)生變性而形成較大的絮凝物沉淀，這些蛋白絮凝物易吸附于膜孔內，從而導至膜孔堵塞。因此，較高溫度時膜孔徑增大、膜孔窄化和蛋白質絮凝物被吸附于膜孔內而導致膜孔堵塞，應是膜通量下降的主要原因。

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Applied research of removing proteins and pigments in enzymatic production of L-tryptophan with membrane separation technology

WEI Ping-he，PENG Jia-ping，ZHOU Xi-liang
(Applied Enzyme Engineering Technology R＆D Center of Jiangsu，Changzhou Institute of Engineering Technology，Changzhou 213164，China)

Purpose The ultrafiltration(UF)combined with nanofiltration(NF)membrane separation was used to remove proteins and pigments from enzymatic conversion solution of L-tryptophan.Methods The conversion solution of L-tryptophan with certain treatments was inputed into UF and NF membrane filtration equipments，and then clear filtrate and cloudy filtrate through these equipments were collected respectively.The efficiency of removing proteins and pigments from the conversion solution with membrane separation was examined by determining the transmittance of the filtrate and adding alkali or ethanol into the filtrate.Results The conversion solution was adjusted to pH 5.5-6.0，and feeding temperature was 20-25 ℃.Under these operating conditions，no proteins were precipitated from the clear filtrate by adding alkali or ethanol.The transmittance of the clear filtrate at 460 nm was above 85%which was of 2.7 times as high as that of activated carbon decolorization.Conclusion The efficiency of membrane separation for removing proteins and pigments from the conversion solution was obviously better than traditional flocculation precipitation and activated carbon decolorization used in the experiment.It developed a green and advanced purification process for enzymatic production of L-tryptophan.

membrane separation;L-tryptophan;ultrafiltration;nanofiltration;protein;pigment

TQ464.7

A

1005-1678(2011)06-0421-05

2011-06-10

常州市科技攻關項目(CE20100018);江蘇省高?！扒嗨{工程”資助項目

韋平和，男，博士，副教授，主要從事生物活性物質的發(fā)酵制備和酶法合成研究，Tel:0519-86332163，E-mail:phwei@czie.email.net。