鐘寧，侯彩云

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

高效毛細(xì)管電泳測(cè)定液態(tài)乳中乳糖

鐘寧，侯彩云

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

針對(duì)常用乳糖測(cè)定方法存在的局限性和不便性，結(jié)合高效毛細(xì)管電泳（HPCE）法簡(jiǎn)單快速、高效低耗的特點(diǎn)，探索出了高效毛細(xì)管電泳儀配合紫外檢測(cè)器測(cè)定乳糖的實(shí)驗(yàn)條件：熔融石英毛細(xì)管（50 μm×34 cm）；緩沖液為50 mmol/L硼砂/NaOH，pH值為10.0；電泳為10 kV，溫度為60℃；檢測(cè)波長為195 nm；進(jìn)樣為5000 Pa；時(shí)間3 s。此方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、精密度好。該方法的測(cè)定結(jié)果與高效液相色譜法的結(jié)果較一致，樣品中其他糖類對(duì)該方法不存在干擾，克服了萊因-埃農(nóng)氏法測(cè)定乳糖不具專一性的缺點(diǎn)。

液態(tài)乳；乳糖；高效毛細(xì)管電泳

0 引 言

乳糖是牛乳中的固有成分，通常多于其他固形物組分，濃度相當(dāng)穩(wěn)定[1]。在乳品工業(yè)中，乳糖的檢測(cè)也是原料乳驗(yàn)收和成品檢驗(yàn)中的重要項(xiàng)目。目前乳糖測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[2-5]、直接滴定法[2,6]、直接比色法[7，8]、近紅外光譜法[9，10]、旋光法[11]、毛細(xì)管電泳法[12-14]等。我國現(xiàn)行的關(guān)于乳糖檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)中推薦高效液相色譜法和萊因-埃農(nóng)氏法[2]，但萊因-埃農(nóng)氏法存在滴定條件不易控制和終點(diǎn)難以確定的缺點(diǎn)，而高效液相色譜法（配合示差折光檢測(cè)器）的穩(wěn)定性、重復(fù)性和選擇性均有一定程度的不足。

近年發(fā)展起來的高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）具有簡(jiǎn)單快速、高效和低耗的特點(diǎn)[15]。本文探索了高效毛細(xì)管電泳法配合紫外檢測(cè)器測(cè)定乳糖的實(shí)驗(yàn)條件，并評(píng)估了該方法的精密度和準(zhǔn)確度。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

高效毛細(xì)管電泳儀（HP3DG1601BA），空心石英毛細(xì)管（50 μm I.D/365 μm O），高效液相色譜儀（泵：HPLC K-501;檢測(cè)器：K-2301示差折光檢測(cè)器），超聲波清洗器，精密pH計(jì)（PHS-3C），高速冷凍離心機(jī)（GL-20G-Ⅱ型），電子天平（FA2004）。

1.1.2 試劑

乳糖（10，20，30，50，70 g/L）、蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖（以上糖類均為20 mg/mL）、0.5 M氫氧化鈉溶液、硼砂溶液（濃度為40，50，60，70，80，90 mmol/L）、飽和氫氧化鈉溶液（20℃）、質(zhì)量濃度為100 g/L三氯乙酸溶液（TCA）；乙酸鋅溶液（21.9 g乙酸鋅+3 mL冰乙酸，純水定容至100 mL）、106 g/L亞鐵氰化鉀溶液；費(fèi)林氏液[2]、次甲基藍(lán)溶液（10 g/L）、乙酸鉛溶液（200 g/L）、草酸鉀-磷酸氫二鈉溶液[2]。

以上均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?，?shí)驗(yàn)用水均為純水。

10種市售液態(tài)乳樣品：樣品1～10，其中樣品1～5為純牛奶，樣品6和7為低乳糖奶（乳糖水解率≥90%），樣品8～10為高端奶。

1.2 方法

1.2.1 毛細(xì)管電泳

（1）樣品預(yù)處理。取40 mL樣品，加入TCA溶液定容至100 mL，3000 r/min離心5 min后過濾[16]。取50 mL濾液加0.9534 g硼砂并溶解，然后用飽和NaOH溶液調(diào)至pH值為10.0，再次用濾紙過濾此溶液并用0.45 μm水系微孔濾膜過濾，轉(zhuǎn)入樣品瓶。進(jìn)樣前超聲處理去除氣泡。

（2）高效毛細(xì)管電泳條件。電泳條件：毛細(xì)管為50 μm×34 cm；緩沖液為濃度50 mmol/L硼砂/NaOH，pH值為10.0；工作電壓及溫度為10 kV和60℃；檢測(cè)波長為195 nm；壓力進(jìn)樣5 000 Pa（3 s）。

新毛細(xì)管在用于電泳分析前先用濃度為0.5mol/L的NaOH溶液沖洗30 min，再依次用純水和緩沖液各沖洗10 min。兩次進(jìn)樣之間，毛細(xì)管用濃度為0.5 mol/L的NaOH溶液沖洗3 min，再依次用純水和緩沖液各沖洗1 min[15]。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。配制質(zhì)量濃度為10，20，30，50，70 g/L乳糖溶液，按上述（2）中電泳條件分別進(jìn)樣。

1.2.2 高效液相色譜

（1）樣品預(yù)處理。稱取液態(tài)乳10 g（精確至0.1 mg），于150 mL帶有磁力攪拌子的燒杯中，加水約50 g溶解，緩慢加入乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液各5 mL，加水至溶液總質(zhì)量為100 g（精確至0.1 mg），磁力攪拌30 min，放至室溫后，用干燥濾紙過濾取約2 mL濾液過0.45 μm微孔濾膜。

（2）高效液相色譜條件。色譜柱為Shodex SPO 810 Pb2+柱；柱溫為80℃；流動(dòng)相為水；流速為1 mL/min。

1.2.3 萊因-埃農(nóng)氏法

按GB5413.5-2010中規(guī)定的方法[2]。

2 結(jié)果和分析

2.1 電泳實(shí)驗(yàn)條件的確定

實(shí)驗(yàn)證明，溫度能夠明顯地影響乳糖的出峰時(shí)間。實(shí)驗(yàn)用質(zhì)量濃度為20 g/L乳糖溶液進(jìn)樣，保持其他電泳條件不變，僅調(diào)節(jié)電泳溫度分別為20，30，40，50，60℃，結(jié)果當(dāng)電泳溫度為60℃時(shí)，出峰時(shí)間最短（圖1）。

圖1中，毛細(xì)管為50 μm×34 cm；緩沖液濃度為50 mmol/L硼砂/NaOH（pH值為10.0）；電泳電壓為10 kV（20～60℃）； 檢測(cè)波長為195 nm； 進(jìn)樣為5 000 Pa（3 s）；1為系統(tǒng)峰，2為乳糖。 下同。

2.1.2 緩沖液硼砂濃度的選擇

緩沖液中硼砂的濃度對(duì)乳糖的出峰時(shí)間及峰面積大小也存在明顯的影響。仍用質(zhì)量濃度20 g/L乳糖溶液進(jìn)樣，保持其他電泳條件不變，僅把緩沖液的硼砂濃度分別設(shè)為40，50，60，70，80，90 mmol/L，電泳結(jié)果顯示50 mmol/L的硼砂緩沖液中乳糖的出峰時(shí)間最短且峰形好（圖2）。

圖2中，緩沖液濃度為40～90 mmol/L硼砂/NaOH，溫度為60℃（下同）。

2.1.3 緩沖液pH值的選擇

本研究中，乳糖的羥基在高pH值溶液中發(fā)生電離，從而與硼酸根離子復(fù)合形成可被紫外檢測(cè)器檢出的復(fù)合物， 因此配制pH值為10，11，12，13的硼砂/NaOH緩沖液，進(jìn)樣仍為質(zhì)量濃度20 g/L乳糖，其他條件不變，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pH值也會(huì)影響乳糖的峰形和出峰時(shí)間，如圖3所示。由圖3可以看出，pH值為10.0時(shí)峰形好且出峰快。

（3）金相檢驗(yàn) 在原材料上取金相試樣，使用德國徠卡DMI5000M智能顯微鏡進(jìn)行顯微觀察，檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示，由表3可知，原材料除顯微組織出現(xiàn)微量的Fe3C外，其他檢驗(yàn)結(jié)果均符合GB/T24238—2009標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)要求。

因此，選取最佳HPCE分析條件：毛細(xì)管為50 μm×34 cm；緩沖液濃度為50 mmol/L硼砂/NaOH；pH值為10.0；電泳電壓為10 kV（60℃）；檢測(cè)波長為195 nm；進(jìn)樣為5 000 Pa（3 s）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

作乳糖質(zhì)量濃度-峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y=7.9397x+3.9293，R2=0.9999。此方法中，乳糖質(zhì)量濃度與峰面積線性相關(guān)性很好。

2.3 HPCE方法的評(píng)價(jià)

2.3.1 HPCE方法的精密度

按1.2.1中方法對(duì)樣品1重復(fù)測(cè)定8次，根據(jù)出峰時(shí)間及峰面積，計(jì)算變異系數(shù)以分析精密度（表1）。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本方法測(cè)定乳糖的出峰時(shí)間、峰面積和乳糖濃度的變異系數(shù)分別為1.1%、1.7%和1.7%，均小于5%，可以判定，本方法具有良好的重復(fù)性。

2.3.2 HPCE方法的準(zhǔn)確度

分析結(jié)果的準(zhǔn)確度由回收率判定，做添加50%、100%、150%乳糖的加標(biāo)回收率試驗(yàn)。取20 mL樣品，按實(shí)驗(yàn)需要加入一定量的乳糖（表2），然后按1.2.1（1）中步驟預(yù)處理，進(jìn)樣、分析條件不變。

本方法的加標(biāo)回收率在50%和100%水平較好，準(zhǔn)確度高，150%水平的加標(biāo)回收率偏高。

2.4 HPCE分析乳糖的結(jié)果

實(shí)驗(yàn)樣品牛乳中乳糖的HPCE圖譜可分為兩類，高乳糖型（圖5）和低乳糖型（圖6）。

表2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）

高乳糖型的譜圖是由純牛奶（樣品1～5）和高端奶（樣品8～10）進(jìn)樣所得，低乳糖型譜圖則由低乳糖奶（樣品6和7）進(jìn)樣得到的結(jié)果。可見，用HPCE分析牛乳中的乳糖具有專一性，即牛乳中存在的其他糖類對(duì)乳糖的分析不存在干擾。

2.5 HPCE與現(xiàn)有方法的比較

HPCE法與HPLC法和萊因埃農(nóng)氏法測(cè)定牛奶中乳糖的結(jié)果比較如圖7所示。

可以看出，3種方法在測(cè)定樣品1～5（普通奶）及樣品8～10（高端奶）時(shí)結(jié)果一致，但HPCE法的測(cè)定結(jié)果普遍偏高。測(cè)定樣品6和7（低乳糖奶）的結(jié)果中，HPCE和HPLC結(jié)果較一致，萊因-埃農(nóng)氏法則結(jié)果過高，原因是萊因-埃農(nóng)氏法是以測(cè)定還原糖的菲林實(shí)驗(yàn)為原理，實(shí)際測(cè)定的是樣品中的還原糖，而非專一測(cè)定乳糖，樣品中如添加其他還原糖，就會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾。

3 討 論

鑒于現(xiàn)有乳糖測(cè)定方法在實(shí)際應(yīng)用中存在的局限及不便性，結(jié)合近年發(fā)展起來的高效毛細(xì)管電泳簡(jiǎn)單快速、高效和低耗的特點(diǎn)，探索出HPCE法用于測(cè)定牛奶中乳糖的實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)驗(yàn)中用三氯乙酸去除牛奶中的蛋白質(zhì)，調(diào)樣品溶液pH至10.0并使樣品溶液中的硼砂濃度為50 mmol/L。HPCE的分析條件如下：毛細(xì)管：50 μm×34 cm； 緩沖液：50 mmol/L硼砂/NaOH（pH值為10.0）；電泳電壓為10 kV（60℃）；檢測(cè)波長為195 nm；進(jìn)樣：5000 Pa（3 s）。 對(duì)HPCE法做精密度和回收率實(shí)驗(yàn)，顯示該方法有良好的精密度和準(zhǔn)確度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果的譜圖均存在明顯的系統(tǒng)峰，如何消除系統(tǒng)峰還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索。并且發(fā)現(xiàn)在兩種樣品類型的譜圖中，乳糖出峰后都出現(xiàn)了其他峰，其具體為何種物質(zhì)，也有待進(jìn)一步分析測(cè)定。

[1]郭本恒.乳品化學(xué)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社,2001：312.

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 5413.5-2010嬰幼兒食品和乳品中乳糖、蔗糖的測(cè)定[S].

[3]吳莉,周紅.應(yīng)用氨基柱測(cè)定奶粉中的糖份[J].武漢化工學(xué)院學(xué)報(bào),2002,24（2）：4-5,8.

[4]WANG X M,ZHANG R L.Determination of Glucosamine and Lactose in Milk-based Formulae by High-performance Liquid Chromatography[J].Journal of Food Composition and Analysis，2008,21：255-258.

[5]FERREIRA I M P L V O,GOMES A M P.Determination of Sugars,and Some Other Compounds in Infant Formulae,Follow-up Milks and Human Milk by HPLC-UV/RI[J].Carbohydrate Polymers，1998,37：225-229.

[6]張鴻軍.乳制品中乳糖檢驗(yàn)方法的探討[J].食品科學(xué),2000,21（12）：115-116.

[7]朱堅(jiān).SN/T 0871-2000進(jìn)出口乳及乳制品中乳糖的測(cè)定方法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2000.

[8]樊宏,陳強(qiáng).乳制品中乳糖直接比色測(cè)定方法探討[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2006,16（3）：296-297.

[9]王麗杰,徐可欣.采用近紅外光譜技術(shù)檢測(cè)牛奶中脂肪、蛋白質(zhì)及乳糖含量[J].光電子·激光,2004,15（4）：468-471.

[10]李慶波,汪曣.牛奶主要成分含量近紅外光譜快速測(cè)量法[J].食品科學(xué),2002,23（6）：121-124.

[11]張忠義,劉振林.牛奶中乳糖的快速旋光儀測(cè)定[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2001,11（4）：434-435.

[12]ZHANG X,CAO Y H.Determination of Lactose in Sugar-free Milk Powder by Capillary Electrophoresis with Electrochemical Detection[J].Food Chemistry，2001,72：385-388.

[13]馬曉麗,孟磊.大蒜多糖中單糖組分的毛細(xì)管電泳研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2010,21（5）：1259-1260.

[14]張欣,丁祥歡.乳糖和麥芽糖水解反應(yīng)速率常數(shù)的毛細(xì)管電泳測(cè)定方法[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2001,20（1）：16-18.

[15]ALTRIA K,ENNIS K,SADLER R.Quantitative and Selective Analysis of Lactose by Capillary Electrophoresis[J].Chromatographia,1999,49：406-410.

[16]丁曉靜,楊媛媛.原料奶、嬰兒配方奶粉及酸奶中蛋白去除效果的研究[J].分析化學(xué)研究報(bào)告,2010,38（1）：77-81.

Determination of lactose in milk by high-performance capillary electrophoresis

ZHONG Ning,HOU Cai-yun
（College of Food Science and Nutrition Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China）

The disadvantage of present usual methods of determination of lactose is their limitations or inconveniences.In this paper,the optimal experimental conditions of determination of lactose in milk by high-performance capillary electrophoresis（HPCE,Agilent,HP3DG1601BA）with UV detector were explored：fused silica capillary（50 μm ID×34 cm）,buffer solution：50 mM borate/NaOH,pH 10.0,HPCE conditions：10 kV,60℃,UV detection at 195 nm,sample was injected at 5 000 Pa for 3 s.This method is easy to operate and has good accuracy and precision.The result of this method is consistent with high-performance liquid chromatography（HPLC）method when they detect the lactose in milk,and other reducing sugars in milk will not interference the result of HPCE method.

milk;lactose;high-performance capillary electrophoresis

TS252.7,TS245.6

A

1001-2230（2011）10-0044-04

2011-07-12

鐘寧（1988-），女，碩士，從事食品質(zhì)量與安全方面的研究。

侯彩云