黎 明，張俊環(huán)，周 政，牛 濤

(工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

載脂蛋白 AI(apoAI)是高密度脂蛋白(HDL)的最主要結構成分，在外周組織中作為游離膽固醇的受體，促進HDL對外周組織中膽固醇的攝?。辉谥鞍妆砻孀鳛槁蚜字懝檀减；D移酶(Lecithin-cholesterol acyltransferase，LCAT)的輔助激活因子，參與膽固醇的酯化；在肝臟表面介導HDL與B族Ⅰ型清道夫受體(scavenger receptor class B type Ⅰ，SR-BI)的作用，將HDL中膽固醇酯轉移到肝臟進行代謝，從而降低膽固醇在外周組織的沉積；另外，apoAI通過其抗炎、抗血栓形成和內皮功能保護等多種作用抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展．動物和臨床實驗證明血漿中apoAI和HDL的含量與動脈粥樣硬化心腦血管病的發(fā)生呈負相關性[1]，apoAI具有明顯的抗動脈粥樣硬化的生物學效應[2]．因此，apoAI基因已經成為預防和治療動脈粥樣硬化癥的靶基因[3]．

載脂蛋白AI米蘭突變體(AIM)是第一個被發(fā)現(xiàn)的 apoAI的天然半胱氨酸突變體[4]．至今 AIM 攜帶者無一人被檢出動脈粥樣硬化的臨床或病理表征，這主要是由于 AIM 具有獨特的結構[5]和功能特性[6–7]，從而高度保護其攜帶者免于發(fā)生心腦血管疾病．與apoAI相比較，AIM 的構象更穩(wěn)定，在血漿中的半衰期延長；而且鏈間二硫鍵使 AIM 二硫鍵 C末端 40多個氨基酸殘基形成一個新的結構域，呈環(huán)狀突出于HDL顆粒表面，結合脂的能力大大增強[8]，能更有效地排出細胞中的膽固醇，且較少的底物就可激活LCAT；同時，AIM 游離的巰基具有抗脂類氧化的作用[7]．因此 AIM 比 apoAI的抗動脈粥樣硬化的能力更強[7,9]．

大量動物和臨床實驗證明，重組人 AIM 不僅能在短時間內顯著“逆轉”動脈粥樣硬化，而且臨床研究也未見明顯的毒副反應．但是，由于AIM的臨床劑量在克級水平，臨床用量很大，因此AIM用于臨床治療不可能從血液中提取，可依賴基因工程技術將AIM基因在微生物中表達．前期工作已經構建了高效表達AIM的工程菌，為了進一步提高表達量，降低發(fā)酵成本，本文對 AIM 工程菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，為其應用研究和工業(yè)化發(fā)酵生產奠定基礎．

1 材料與方法

1.1 菌株

含質粒pET22b-AIM的重組E.coli BL21，本實驗室保存．

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10，氨芐青霉素 0.05，pH 7.0．

原始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 10，蛋白胨 10，NaCl 10，氨芐青霉素 0.05，pH 7.0．

1.3 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：從平板上挑取重組 E.coli BL21單菌落，接種到裝有 30,mL種子培養(yǎng)基的 250,mL搖瓶中，37,℃、200,r/min 培養(yǎng) 14,h，制成種子液．

原始發(fā)酵培養(yǎng)：按 6%的接種量將種子液接種到裝有 30,mL原始發(fā)酵培養(yǎng)基的 250,mL搖瓶中，37,℃、200,r/min培養(yǎng) 2～3,h，當 A600為 0.8時，加入IPTG至終濃度為0.6,mmol/L，誘導4,h．

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

基于微生物對營養(yǎng)利用情況及成本的比較，在文獻[10]的基礎上，運用單因素實驗篩選出最適碳、氮源及最適濃度．

1.4.1 碳源的選擇

以10,g/L的蛋白胨為氮源，10,g/L的NaCl為無機離子，分別加入 10,g/L的葡萄糖、蔗糖和甘油進行發(fā)酵，篩選出最適碳源；再以 10,g/L的蛋白胨為氮源，10,g/L的 NaCl為無機離子，加入 5、10、15,g/L的最適碳源，篩選出最適碳源的最適濃度．

1.4.2 氮源的選擇

以最適濃度的最適碳源和 10,g/L的 NaCl為培養(yǎng)基基本組分，分別加入 10,g/L的酵母粉、蛋白胨、黃豆餅粉，經發(fā)酵篩選出最適有機氮源；再以最適濃度的最適碳源和10,g/L的NaCl為培養(yǎng)基基本組分，加入 5、10、15,g/L的最適有機氮源，篩選出最適有機氮源的最適濃度．

以最適濃度的最適碳氮源和 10,g/L的 NaCl為培養(yǎng)基基本組分，分別加入含氮量為0.56,g/L的不同無機氮源(g/L)：硫酸銨 2.64、硝酸銨 1.60和氯化銨2.12，篩選出最適無機氮源；再以最適濃度的最適碳氮源和10,g/L的NaCl為培養(yǎng)基基本組分，分別加入2、3、4,g/L的最適無機氮源，篩選出最適無機氮源的最適濃度．

1.4.3 正交實驗

利用 L9(33)正交實驗篩選出蔗糖、酵母粉和硫酸銨的最佳配比．

1.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1 裝液量的確定

以原始發(fā)酵培養(yǎng)為基礎，分別將種子液接種到不同體積的最適發(fā)酵培養(yǎng)基中，篩選出最適裝液量．

1.5.2 接種量的確定

以原始發(fā)酵培養(yǎng)為基礎，分別按不同的接種量進行接種，篩選出最適接種量．

1.5.3 誘導時機的確定

以原始發(fā)酵培養(yǎng)為基礎，分別在 A600為 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4時加入 IPTG 進行誘導，篩選出最適誘導時機．

1.5.4 誘導劑量的確定

以原始發(fā)酵培養(yǎng)為基礎，加入 IPTG至終濃度分別為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2,mmol/L，篩選出最適誘導劑量．

1.5.5 誘導時間的確定

以原始發(fā)酵培養(yǎng)為基礎，分別誘導 3、4、5、6、7、8,h，篩選出最適誘導時間．

1.6 分析方法

1.6.1 生物量的測定

以未接種的發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對照，測定不同培養(yǎng)時期發(fā)酵液在 600,nm 波長下的吸光度，使其在0.10～0.65之間，經稀釋后測得的 A600乘以稀釋倍數(shù)即為生物量的值．

1.6.2 SDS-PAGE蛋白電泳

收集發(fā)酵菌體，完全超聲破碎后離心取上清液，用 15%分離膠和 5%濃縮膠進行 SDS-PAGE．電泳完畢后分別用考馬斯亮藍染色液和脫色液進行染色和脫色．

1.6.3 AIM表達量的測定

以不含質粒的 E.coli BL21為對照，采用改良的Bradford蛋白質定量檢測試劑盒測定 AIM 的表達量．操作方法：取 4 μL蛋白標準液(牛血清白蛋白溶液)加 PBS稀釋至 100,μL(一般可用 PBS稀釋標準品)，使終濃度為 200,μg/mL；將稀釋后標準品按 0、1、4、6、8、10、15,μL 分別添加到 96 孔板中，加 PBS 補足至 20,μL，每孔蛋白含量分別為：0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0,μg；加適當體積樣品到 96 孔板中，加 PBS至 20,μL；各孔加 200,μL Bradford Reagent，混勻，室溫放置 5,min；用預熱的酶標儀測定 A595并繪制標準曲線，計算樣品中的蛋白濃度．

2 結果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 碳源

由表 1可知，以葡萄糖為碳源的菌體 A600最大，以蔗糖為碳源的菌體 A600稍低，但是 AIM 的表達量最高，故選用蔗糖作為碳源．蔗糖最適濃度實驗結果表明，質量濃度為 10,g/L時 AIM 表達量最高，達1.625,g/L．

表1 不同碳源下工程菌的生物量及AIM表達量Tab.1 Biomass and AIM expression levels of engineering bacteria for different carbon sources

以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基AIM表達量反而不及另外兩種培養(yǎng)基，可能是由于微生物在利用葡萄糖作為碳源時，葡萄糖降解速度較快，使得降解速度超過菌體吸收速度，一些葡萄糖代謝物如丙酮酸、乙酸等在細胞內積累，從而降低了環(huán)境的 pH，抑制了菌體代謝物的產出．

2.1.2 氮源

有機氮源在發(fā)酵培養(yǎng)基中不僅是菌體生長繁殖的營養(yǎng)，有些還是某些產物合成的前體．常用的有機氮源有酵母粉、蛋白胨、花生餅粉、黃豆餅粉等．本實驗用酵母粉、蛋白胨、黃豆餅粉作試用氮源．由表 2可知，以酵母粉為氮源的菌體A600最大，且AIM的表達量最高，因此選用酵母粉作為有機氮源．酵母粉最適濃度實驗結果表明，質量濃度為 10,g/L時 AIM 表達量最高，達1.648,g/L．

無機氮源吸收快、易利用、成分簡單．在確定了碳源和有機氮源之后，以硫酸銨、硝酸銨、氯化銨為無機氮源，考察其對菌體生長及 AIM 表達量的影響．由表 3可知，以硝酸銨為氮源的菌體 A600最大，其次為硫酸銨，但以硫酸銨為氮源的AIM 表達量最高，因此選用硫酸銨作為無機氮源．硫酸銨最適濃度實驗結果表明，質量濃度為4,g/L時AIM表達量最高，達1.772,g/L．

表2 不同有機氮源下工程菌的生物量及AIM表達量Tab.2 Biomass and AIM expression levels of engineering bacteria for different organic nitrogen sources

表3 不同無機氮源下工程菌的生物量及AIM表達量Tab.3 Biomass and AIM expression levels of engineering bacteria for different inorganic nitrogen sources

2.1.3 正交實驗

由表 4可知，在蔗糖、酵母粉和硫酸銨 3種培養(yǎng)基組分的不同配比中，AIM 表達量最高的組合為(g/L)：蔗糖 10，酵母粉 10，硫酸銨 6．極差分析結果表明硫酸銨對菌體生長的影響最大，蔗糖次之，酵母粉的影響較?。?/p>

表4 正交實驗Tab.4 Orthogonal test

優(yōu)化后的最適發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L)：蔗糖 10、酵母粉 10、硫酸銨 6和 NaCl 10．由圖 1可知，重組E.coli BL21在最適發(fā)酵培養(yǎng)基中生長情況良好，而且AIM 的表達量達 1.775 g/L，是在原始培養(yǎng)基中表達量的1.247倍．

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化前后的生物量及AIM的表達量Fig.1 Biomass and expression levels for fermentation medium optimization

2.2 發(fā)酵條件

2.2.1 裝液量

由圖2可知，裝液量對AIM表達量的影響較大，在 10～30,mL時 AIM 表達量逐漸升高，在 40～60,mL時 AIM 表達量嚴重下降，表明充足的氧供應是菌體生長和高表達 AIM 的必需條件．因此，發(fā)酵時裝液量應控制在30,mL．

圖2 裝液量對AIM表達量的影響Fig.2 Effect of media volume on the expression of AIM

2.2.2 接種量

接種量的大小決定于生產菌種的生長繁殖速度，較大的接種量可以縮短菌體繁殖達到高峰的時間，使產物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機會．但接種量過大或者過小，均會影響發(fā)酵．過大會引起溶氧不足，影響產物合成，而且會過多產生代謝廢物；過小會延長培養(yǎng)時間，降低生產率．由圖 3可知，接種量為8%時AIM表達量最高．

圖3 接種量對AIM表達量的影響Fig.3 Effect of inoculum size on the expression of AIM

2.2.3 誘導時機

誘導時機是影響 AIM 表達量的重要工藝參數(shù)．由圖 4可知，在 A600為 1.0 時誘導，AIM 的表達量最高．

圖4 誘導時機對AIM表達量的影響Fig.4 Effect of induction opportunity on the expression of AIM

2.2.4 誘導劑量

工程菌中的表達載體為 IPTG誘導型表達載體，因此 AIM 的表達必須加入 IPTG進行誘導．由圖 5可知，終濃度0.8,mmol/L的IPTG誘導效果最佳．

圖5 誘導劑量對AIM表達量的影響Fig.5 Effect of induction concentration on the Expression Fig.5 of AIM

2.2.5 誘導時間

由圖6可知，隨著誘導時間從3,h到6,h，AIM表達量逐漸增加并達到最高，繼續(xù)增加誘導時間，AIM并沒有發(fā)生降解．因此，選擇誘導時間為6,h．

圖6 誘導時間對AIM表達量的影響Fig.6 Effect of induction time on the expression of AIM

2.3 驗證實驗

通過對重組大腸桿菌BL21/pET22b-AIM發(fā)酵條件的研究，確定其最適發(fā)酵條件為：裝液量30 mL，接種量8%，誘導時機A6001.0，誘導濃度0.8 mmol/L，誘導時間 6 h．發(fā)酵后的蛋白樣品經 SDS-PAGE電泳后，在 28.0 ku有清晰明顯條帶(如圖 7所示)，和AIM的結果一致．由圖8可知，在最適發(fā)酵培養(yǎng)基和最適發(fā)酵條件下AIM的表達量可達2.26 g/L，是優(yōu)化前的1.58倍．

圖7 發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化前后的SDS-PAGEFig.7 SDS-PAGE for fermentation medium and fermentation conditions optimization

圖8 最適發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下的生物量及AIM表達量Fig.8 Biomass and expression level in optimized fermentation medium and conditions

3 結 論

本實驗基于微生物對營養(yǎng)利用情況及成本的比較，運用單因素實驗和 L9(33)正交實驗篩選出最適發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L)：蔗糖 10，酵母粉 10，硫酸銨 6和NaCl 10；單因素實驗篩選出最適發(fā)酵條件為：裝液量30,mL，接種量 8%，誘導時機 A6001.0，誘導濃度 0.8 mmol/L，37,℃、200,r/min 誘導 6,h，AIM 的表達量達2.26,g/L，是未優(yōu)化條件下的1.58倍．

［1］ Sedlis S P，Schechtman K B，Ludbrook P A，et al. Plasma apoproteins and the severity of coronary artery disease[J]. Circulation，1986，73(5)：978-986.

［2］ Paszty C，Maeda N，Verstuyft J，et al. Apolipoprotein AI transgene corrects apolipoprotein E deficiency-induced atherosclerosis in mice[J]. J Clin Invest，1994，94(2)：899-903.

［3］ Fruchart J C，Duriez P. High density lipoprotein and coronary heart disease. Future prospects in gene therapy[J].Biochimie，1998，80(2)：167-172.

［4］ Gualandri V，F(xiàn)ranceschini G，Sirtori C R，et al. AIMilano apoprotein indentification of the complete kindred and evidence of a dominant genetic transmission[J]. Am J Hum Genet，1985，37(6)：1083-1097.

［5］ Calabresi L，F(xiàn)ranceschini G，Burkybile A，et al. Activtion of lecithin-cholesterol acyltransferase by a disulfide bridge remarkably alters apolipoprotein A-I dimmer[J].Biochem Biophys Res Commun，1997，232：345-349.

［6］ Calabresi L，F(xiàn)ranceschini G，Sirtori C R，et al. Inhibition of VCAM-1 expresson in endothelial cells by reconstituted high density lipoproteins[J]. Biochem Biophys Res Commun，1997，238(1)：61-65.

［7］ Bielicki J K，Oda M N. Apolipoprotein A-I(Milano)and apolipoprotein A-I(paris)exhibit an antioxidant activity distinct from that of wild-type apolipoprotein A-I[J].Biochemistry，2002，41(6)：2089-2096.

［8］ Calabresi L，Vecchio G，Longhi R，et al. Molecular characterization of native and recombinant apolipoprotein A-I Milano dimmer[J]. J Biol Chem，1994，269(51)：32168-32174.

［9］ Shah P K，Yano J，Reyes O，et al. High-dose recombinant apolipoprotein A-I(milano)mobilizes tissue cholesterol and rapidly reduces plaque lipid and macrophage content in apolipoprotein e-deficient mice. Potential implications for acute plaque stabilization[J]. Circulation，2001，103(25)：3047-3050.

［10］馬文峰，丁滿生，郭美錦，等．重組人載脂蛋白 ApoA-I表達條件的優(yōu)化[J]. 微生物學通報，2004，31(6)：27-32．