俞 飛，侯 平，宋 琦，郭 明，吳 俊

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300；2.杭州萬向職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物技術(shù)系，浙江 杭州310023；3.浙江省金華市森林病蟲防治站，浙江 金華 321017）

自毒作用已被證實是影響森林更新的重要生化因素之一［1－4］。目前，對于森林自毒作用的研究主要集中于北方森林，對南方森林的研究較少。在對南方森林進行調(diào)查的過程中，作者發(fā)現(xiàn)，柳杉Cryptomeria fortunei林的天然更新狀況與受自毒作用影響的北方針葉林的更新狀況非常相似：天然更新成功率幾乎為0，僅林窗中偶有發(fā)生［5］。這是否意味著柳杉林同樣也遭受著自毒作用的困擾呢？柳杉不僅是中國南方主要用材樹種之一，也是中國特有樹種。尤其是浙江天目山國家級自然保護區(qū)的柳杉林，歷史悠久，植株高大，形成了世界罕見的大柳杉群落，其中胸徑超過50 cm的柳杉達2 032株，占總數(shù)的37%，天目山因此也獲得了 “大樹華蓋聞九州”的美譽。因此，對柳杉林的自毒作用進行研究，并選擇天目山柳杉林作為試驗地，對南方森林的天然更新研究和柳杉這一珍貴樹種遺傳基因的保護都有著重要意義。前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，天目山柳杉種子主要落在其枯枝落葉層和腐殖質(zhì)層［6］。凋落物又是自毒物質(zhì)的主要來源之一［7－8］。因此，從柳杉凋落物的自毒作用入手進行探索。柳杉球果成熟時間為10－11月，種子萌發(fā)為翌年的3－4月。這一期間是化感物質(zhì)對種子產(chǎn)生影響的重要階段，所以本研究選擇2006年10月至2007年4月為研究時間。

1 材料與技術(shù)路線

1.1 試驗材料與儀器

在天目山柳杉林中按文獻［9］的方法取樣。取樣后混合帶部分回實驗室冷藏備用。收集樣品分3個部分：未分解凋落物、半分解凋落物和表層土壤（0～5 cm）。在相同樣地中，以同樣方法收集1次·月－1。收集時間為2006年10月至2007年 4月。

柳杉種子采自浙江天目山國家級自然保護區(qū)，4℃冰箱中保存。

儀器：Waters 600E高效液相色譜儀，恒溫培養(yǎng)箱。

試劑：阿魏酸，肉桂酸，對羥基苯甲酸對照品。

1.2 樣品含水率測定

采回的樣品取部分稱量，然后放入烘箱中80℃烘至恒質(zhì)量，再稱量［9］，計算含水率，計算公式：絕干含水率 ＝（濕質(zhì)量－絕干質(zhì)量）/絕干質(zhì)量 ×100%［10］。

1.3 浸提液和培養(yǎng)液的制備

1.3.1 浸提液制備［11］將未分解凋落物、半分解凋落物和表層土壤的鮮樣用蒸餾水浸泡48 h，過濾。水浸液母液質(zhì)量體積比例為1∶10，即相當(dāng)于1 g烘干樣加10 mL水。取部分濾液用蒸餾水稀釋獲得1∶100，1∶200和1∶250比例的稀釋液。各比例的浸提液置于冰箱中備用，使用前在0.5 Pa下用高壓滅菌鍋消毒30 min，放置冷卻再用。

1.3.2 培養(yǎng)液制備 稱取肉桂酸對照品用蒸餾水配制成20 mg·L－1的待用母液，分別稀釋成10.0，5.0和0.5 mg·L－1的溶液。阿魏酸、對羥基苯甲酸溶液配制方法同肉桂酸。

1.4 種子活力狀況測定

將消毒過的柳杉種子置于墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，放置種子100?！っ螅?，設(shè)3個重復(fù)。加入相應(yīng)提取液5 mL·皿－1，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對照用蒸餾水。培養(yǎng)條件：空氣相對濕度為60%，溫度23～27℃，無光照。發(fā)芽器皿均在105℃條件下消毒2 h。安置發(fā)芽的當(dāng)天為第1天，以后加相應(yīng)溶液0.5 mL·d－1，以種子周圍不出現(xiàn)水膜為宜。第12天統(tǒng)計種子發(fā)芽勢，第20天統(tǒng)計種子發(fā)芽率［12］。以浸提液對種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響為標(biāo)準(zhǔn)，衡量浸提液化感強度。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

對各浸提液化感強度進行比較時，其統(tǒng)計假設(shè)檢驗和方差分析均以敏感指數(shù)（IR，response index）進行。敏感指數(shù)為Williamson［13］提出的衡量化感效應(yīng)的敏感指數(shù)，當(dāng)IR＞0時表示浸提液對種子萌發(fā)具有促進作用，IR＜0時表示浸提液對種子萌發(fā)有抑制作用。敏感指數(shù)的絕對值代表作用強度的大小。計算公式為：IR＝1－C/T（T≥C）；IR＝TC（T≤C）。其中IR為敏感指數(shù)，C為對照值，是以蒸餾水培養(yǎng)的種子發(fā)芽勢或發(fā)芽率平均值。T為處理值，是以浸提液培養(yǎng)的種子發(fā)芽勢或發(fā)芽率平均值。

1.6 高效液相色譜法測定條件

參照Lodih［14］的方法，并作適當(dāng)修改，提取、分離凋落物中的酸性組分。測定條件如下。色譜柱：反相symmetry C18柱；流動相：乙腈 ∶體積分?jǐn)?shù)0.5%乙酸水 ＝43∶57；柱溫：室溫；流速：1 mL·min－1；檢測器：2996型紫外檢測器；檢測波長：280 nm，進樣量10 μL。比較樣品與標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時間，確定其所含主要化感物質(zhì)的種類，并計算含量。

1.7 生物測定

生物測定的前期處理及數(shù)據(jù)處理方法同1.4節(jié)。第20天統(tǒng)計胚根，胚軸長。以培養(yǎng)液對種子胚根長和胚軸長的影響為標(biāo)準(zhǔn)衡量培養(yǎng)液化感強度，數(shù)據(jù)分析均以IR值進行，具體方法同1.5節(jié)。

酶提取液的制備：將發(fā)芽種子先用流水沖洗，再用去離子水沖洗，濾紙吸干浮水。稱取0.5 g左右置于預(yù)冷的研缽中，先加入20 mL預(yù)冷的提取介質(zhì)50 mmol·L－1pH 7.8的磷酸緩沖液（含10.0 g·L－1聚乙烯吡咯烷酮）充分研磨成勻漿，然后用20 mL提取介質(zhì)沖洗研缽至50 mL離心管中，于4℃下1萬 r·min－1離心20 min，上清液即為酶提取液，在0～4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

采用氮藍四唑法測定柳杉種子中的超氧化物歧化酶（SOD）的活性［15］。

采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定柳杉種子中丙二醛（MDA）質(zhì)量分?jǐn)?shù)［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 凋落物浸提液對柳杉種子萌發(fā)的影響

由表1～2可知，柳杉未分解凋落物、半分解凋落物和表層土壤的高質(zhì)量濃度浸提液（1∶10）對柳杉種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢均有抑制作用。抑制強度隨著比例降低而減弱，甚至消失（1∶250）。抑制作用從當(dāng)年的10月至翌年4月，即柳杉種子下落到萌發(fā)結(jié)束這段時間一直存在。

表1 凋落物浸提液對種子發(fā)芽率化感效應(yīng)的影響Table 1 Effect of extract on alleolpathy of seed germination rate

未分解凋落物、半分解凋落物和表層土壤的浸提液（1∶10）對柳杉種子發(fā)芽率的平均化感強度分別為－0.326，－0.230和－0.212；對發(fā)芽勢的平均化感強度分別為－0.417，－0.307和－0.251?？梢姡捶纸獾蚵湮锝嵋旱淖远咀饔脧姸茸畲?，半分解凋落物其次，表層土壤最小。柳杉每年都會產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的凋落物［16］。初步推測：未分解凋落物釋放的化感物質(zhì)是柳杉林下化感物質(zhì)的主要來源。位于最上層的未分解凋落物通過降水淋溶等作用釋放出來，再經(jīng)重力等作用下滲到未分解凋落物和表層土壤中。為證實這一點，本研究對柳杉凋落物中的自毒物質(zhì)的種類和含量進行了鑒定。

從結(jié)果還可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)年11月和翌年4月的抑制作用最強，而其他月份變化幅度不大。研究表明，溫度、降水等是影響自毒強度的重要外因［17］。

2.2 凋落物自毒作用強度與含水率的關(guān)系

為探究當(dāng)年11月和翌年4月自毒強度較其他月份高的原因，對凋落物含水率與自毒強度關(guān)系進行了研究。已知各浸提液在1∶10下對柳杉種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢影響最顯著。綜合考慮，只對該比例浸提液的自毒作用強度與含水率進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明（圖1），未分解凋落物浸提液對柳杉種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢的抑制強度隨著樣品含水率的增加而增強。相關(guān)系數(shù)分別為－0.993 4和－0.930 4。這與前人研究結(jié)果一致［17］。

表2 凋落物浸提液對種子發(fā)芽勢化感效應(yīng)的影響Table 2 Effect of extract on allelopathy seed germination vigor

半分解凋落物和林下表層土壤浸提液自毒作用強度與其含水率相關(guān)性并不顯著，也就是說這2層的有效自毒物質(zhì)含量并不會隨著水分的增加而增加。表1～2表明，凋落物自毒作用強度隨著層次的下降而減小?？梢赃M一步推測：凋落物和表層土壤中的自毒物質(zhì)來自于未分解凋落物。

圖1 各層凋落物含水率與化感強度的相關(guān)性Figure 1 Correlation of water content and autotoxicity

2.3 凋落物中自毒物質(zhì)的鑒定

為進一步證明柳杉凋落物對其種子萌發(fā)的自毒作用，同時確定未分解凋落物是自毒物質(zhì)的主要來源，本研究對其中的自毒物質(zhì)進行了鑒定。預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，柳杉凋落物中的酸性組分對種子的自毒作用最強。研究表明，酚酸類化合物是目前發(fā)現(xiàn)的自毒物質(zhì)中最重要的種類之一，它不僅是導(dǎo)致農(nóng)作物、果園連茬障礙的重要因子［18］，也是影響森林尤其是針葉林自我更新關(guān)鍵生化因素［1，19－20］。所以，從酸性組分入手，鑒定柳杉凋落物中的自毒物質(zhì)。已發(fā)現(xiàn)的具有自毒作用的有機酸類生物活性物質(zhì)有上百種，如果對每一種物質(zhì)進行檢測不現(xiàn)實。根據(jù)前人研究結(jié)果，本研究選擇了阿魏酸、肉桂酸和對羥基苯甲酸這3種具有代表性的酚酸作為檢測對象。

高效液相鑒定結(jié)果表明，柳杉未分解凋落物、半分解凋落物和表層土壤混合物（為簡化試驗，將半分解凋落物和表層土壤樣品混合進行處理）中均含有阿魏酸、肉桂酸和對羥基苯甲酸（表3）。另外，通過測定可知，未分解凋落物中阿魏酸、肉桂酸和對羥基苯甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.182，0.103和0.356 mg·g－1；半分解凋落物和表層土壤混合物中3種物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.149，0.067 和 0.145 mg·g－1。由此可見，3 種物質(zhì)在未分解凋落物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于其他2層。綜合第一、二部分試驗，推斷未分解凋落物是這3種酚酸類化感物質(zhì)的主要來源。

表3 凋落物化感物質(zhì)的鑒定Table 3 Autotoxicities analysis in Cryptomeria fortunei litter

表4 培養(yǎng)液對種子胚根長和胚軸長的效應(yīng)Table 4 Effects of culture solution on seed germination

2.4 培養(yǎng)液對柳杉種子萌發(fā)的效應(yīng)

2.4.1 培養(yǎng)液對柳杉種子萌發(fā)的形態(tài)效應(yīng) 肉桂酸等酚酸類物質(zhì)雖然已被證實是影響多種植物的生長自毒物質(zhì)［21］，但是自毒物質(zhì)具有高度選擇性和專一性［1］，即肉桂酸等柳杉凋落物的自毒物質(zhì)還需試驗加以證明，所以將肉桂酸等單品配制成不同質(zhì)量濃度溶液培養(yǎng)柳杉種子，進行生物測定。從表4中可以看出，在質(zhì)量濃度為20.00 mg·L-1時，3種酚酸對柳杉種子胚根生長均具有顯著抑制作用，阿魏酸和對羥基苯甲酸對柳杉種子胚軸生長具有顯著抑制作用。隨著質(zhì)量濃度降低，抑制作用強度降低。

2.4.2 培養(yǎng)液對柳杉種子萌發(fā)的生理效應(yīng) 超氧化物歧化酶是植物體內(nèi)防御活性氧傷害的保護酶之一，具有高效清除超氧自由基的作用。丙二醛是植物膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，其質(zhì)量摩爾濃度可以作為植物在逆境脅迫下傷害程度的指標(biāo)。質(zhì)量摩爾濃度增加說明膜脂過氧化作用增強，質(zhì)膜透性增大［22］。根據(jù)圖2可知，3種物質(zhì)對柳杉種子萌發(fā)時的生理狀況具有顯著影響。其作用趨勢和對種子胚根、胚軸的影響一致，即高質(zhì)量濃度的培養(yǎng)液增大細胞質(zhì)膜的通透性，降低超氧化物歧化酶的活性，從而抑制種子的胚根和胚軸的生長。隨著質(zhì)量濃度降低，作用減弱。

圖2 培養(yǎng)液對種子生理活性的效應(yīng)Figure 2 Effects of culture solution on seed physiological activity

3 結(jié)論

本研究在柳杉種子成熟到萌發(fā)這一時期進行了連續(xù)試驗，發(fā)現(xiàn)柳杉凋落物多對其種子萌發(fā)具有自毒作用，而且這一作用是長期存在的。柳杉凋落物中存在酚酸類化感物質(zhì)阿魏酸、肉桂酸和對羥基苯甲酸。未分解凋落物是這3種化感物質(zhì)的主要來源。

自毒作用產(chǎn)生的影響在整個柳杉天然更新中所占的比例究竟有多大，還需要更多的試驗加以證實。如果自毒作用是柳杉天然更新的關(guān)鍵因素之一，那如何消除凋落物的自毒作用影響也將是一個新的命題。

此外，由于自毒物質(zhì)主要是由柳杉未分解凋落物產(chǎn)生的，經(jīng)雨水浸泡釋放出來后，在重力的作用下必定會在半分解凋落物層和土壤層匯集。但是，本研究發(fā)現(xiàn)隨著層次的下降自毒作用強度反而減弱，這是否是因為這2層中的微生物發(fā)揮作用，將這些有毒物質(zhì)分解為無毒物質(zhì)了呢？如果是這樣，那到底是那種微生物在發(fā)揮作用？這些都有待開展進一步的研究。

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