崔潔，孔祥珍，華欲飛，周惠明

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫，214122)

小麥面筋蛋白可控酶解機(jī)理及動(dòng)力學(xué)特性研究*

崔潔，孔祥珍，華欲飛，周惠明

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫，214122)

采用Alcalase 2.4L FG對(duì)小麥面筋蛋白進(jìn)行酶解，在溫度60℃、pH 9.0的條件下通過探討不同底物濃度及酶濃度的變化對(duì)水解度的影響，來研究小麥面筋蛋白的動(dòng)力學(xué)特性，建立了關(guān)于水解速率及水解度的動(dòng)力學(xué)模型，討論了臨界底物濃度和臨界酶濃度，同時(shí)計(jì)算出米氏常數(shù)Km=1.321 1%、最大反應(yīng)速率Vmax=0.327 9 mol/(L·h)，通過對(duì)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與實(shí)際酶解情況間的誤差很小，說明此模型具有良好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值;還探討了可控酶解機(jī)理，為更好地理解間歇酶解反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。

小麥面筋蛋白，堿性蛋白酶，酶解，動(dòng)力學(xué)特性

小麥面筋蛋白作為生產(chǎn)小麥淀粉的副產(chǎn)物，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，但其溶解性比較差，給綜合利用帶來了困難。小麥面筋蛋白在水相中的溶解性有限是由于蛋白分子比較大以及由非共價(jià)作用(包括氫鍵和疏水相互作用)引起的分子間聚集所造成的［1］;小麥面筋蛋白在天然態(tài)時(shí)的溶解性很低是因?yàn)樗菢O性氨基酸殘基很多，而可解離側(cè)鏈氨基酸很少，研究表明，酶水解能夠大大改善小麥面筋蛋白的溶解性及功能性質(zhì)［2－4］。

蛋白質(zhì)酶解技術(shù)是應(yīng)用酶將蛋白質(zhì)水解成分子量較小的多肽及氨基酸，以利于吸收及利用，通過控制水解條件及水解度可獲得目標(biāo)分子量的肽段。建立描述蛋白質(zhì)酶解過程的動(dòng)力學(xué)模型，不僅能從理論意義上加深對(duì)蛋白質(zhì)酶解過程的理解，而且能有效地指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐，從模型推算出獲得目標(biāo)水解產(chǎn)物所需的酶解條件。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)堿性蛋白酶水解小麥面筋蛋白的過程進(jìn)行研究，從而建立酶解動(dòng)力學(xué)模型，并闡述酶解反應(yīng)機(jī)理，為進(jìn)一步深入理解酶解過程及工業(yè)化應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)及參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥面筋蛋，安徽瑞福祥食品有限公司，蛋白質(zhì)含量70.95%;Alcalase 2.4L FG，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司，活力180 000 U/mL;其它試劑均為分析純，市售。

GX-2005高溫循環(huán)器，上海比郎儀器有限公司;90型恒溫磁力攪拌器，上海滬西分析儀器廠;DELTA320PH計(jì) Mettler-Toledo Instruments(SH)Ltd。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 pH-state法酶解過程

稱取一定量的小麥面筋蛋白，在攪拌條件下慢慢加入到一定量的去離子水中，使之形成一定底物濃度的懸浮液，待底物分散均勻后，升溫至60℃并調(diào)pH 9.0，平衡片刻后，按比例迅速加入一定量的酶液，反應(yīng)過程中維持體系pH恒定，根據(jù)所加堿液體積計(jì)算不同時(shí)間的水解度。

1.2.2 水解度(DH)的計(jì)算

蛋白質(zhì)的水解度指蛋白質(zhì)在水解反應(yīng)過程中被水解的肽鍵的百分?jǐn)?shù)，采用pH-Stat法［5］，可由下式計(jì)算:

其中:B為所消耗的堿液體積，mL;Nb為堿液的當(dāng)量濃度，mol/L;α為α-氨基解離度;Mp為底物中蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g;htot為底物中蛋白質(zhì)的肽鍵總數(shù)(mN/g白質(zhì))，對(duì)小麥面筋蛋白，htot=8.38。

2 結(jié)果與討論

2.1 Alcalase酶解小麥面筋蛋白動(dòng)力學(xué)模型研究

2.1.1 酶解動(dòng)力學(xué)參數(shù)及方程的確定

Alcalase 2.4L FG酶解小麥面筋蛋白，該水解反應(yīng)符合雙底物順序反應(yīng)機(jī)理［6］，在pH值和溫度恒定的條件下，總水解速率的指數(shù)形式動(dòng)力學(xué)方程如下［7］:

該方程可描述水解度與水解時(shí)間的關(guān)系，相應(yīng)的變化曲線呈現(xiàn)對(duì)數(shù)函數(shù)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)通過研究不同初始底物濃度及酶濃度對(duì)水解度的影響，從而確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)，進(jìn)而確定動(dòng)力學(xué)方程。酶解條件為:溫度60℃、pH 值 9.0、底物濃度(1%、3%、5%、7%、9%)、酶濃度(0.025%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%)，酶解進(jìn)程曲線如圖1和圖2。

圖1 不同底物濃度的水解進(jìn)程曲線

圖2 不同酶濃度的水解進(jìn)程曲線

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，由不同底物濃度S0和酶濃度E0下的x、t值(即水解度與酶解時(shí)間)，采用SAS V8統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行非線性回歸分析，可求出相應(yīng)的a、b值(見表1)。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，b值的變化并不大，基本在其平均值0.209周圍波動(dòng)，也就是說，在pH及溫度恒定的酶解反應(yīng)體系中，b值接近一個(gè)常數(shù);而a值隨底物濃度S0的增大而減小，隨酶濃度E0的增大而增大。

以a對(duì)E0/S0作圖，如圖3所示。

由上述方程可知，a與E0/S0的曲線關(guān)系所對(duì)應(yīng)的方程為:

將上述求得的a值表達(dá)式和b的平均值代入方程(1)、(3)，可分別得到小麥面筋蛋白酶解的動(dòng)力學(xué)模型方程。

表1 小麥面筋蛋白酶解動(dòng)力學(xué)參數(shù)值

圖3 a與E0/S0的相關(guān)性曲線

從方程(6)可以看出，當(dāng)?shù)孜餄舛群兔笣舛纫欢〞r(shí)，隨水解時(shí)間的延長，水解度增大;在水解時(shí)間一定的前提下，當(dāng)酶濃度不變時(shí)，水解度隨底物濃度的增大而減小;當(dāng)?shù)孜餄舛炔蛔儠r(shí)，水解度隨酶濃度的增大而增大;這與表1中所得參數(shù)值的變化相符合。

由水解速率方程可以分別得到小麥面筋蛋白酶解反應(yīng)的臨界酶濃度E0=(0.948 2/278.82)S0及臨界底物濃度S0=(278.82/0.948 2)E0，也就是說，當(dāng)?shù)陀诖伺R界酶濃度或高于此臨界底物濃度時(shí)，酶解反應(yīng)很難發(fā)生或根本不會(huì)發(fā)生。

2.1.2 動(dòng)力學(xué)模型的驗(yàn)證

選取E0/S0為0.010、溫度 60℃、pH值9.0時(shí)的實(shí)際酶解進(jìn)程曲線與理論模型計(jì)算所得的酶解進(jìn)程曲線進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4所示。

圖4 動(dòng)力學(xué)模型驗(yàn)證曲線

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，由理論計(jì)算出的水解度繪制而成的酶解進(jìn)程曲線與實(shí)際酶解進(jìn)程曲線相當(dāng)一致，誤差很小，因此，該動(dòng)力學(xué)模型具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，可在實(shí)際中用來指導(dǎo)生產(chǎn)，計(jì)算不同水解時(shí)間所對(duì)應(yīng)的水解度。

2.1.3 米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax的測(cè)定

改變底物濃度及酶濃度，在60℃、pH值9.0的條件下進(jìn)行酶解，通過不同條件下水解反應(yīng)的初始速率，根據(jù)Lineweaver-burk雙倒數(shù)方程，即:

以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，初始反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作圖求解，結(jié)果如圖5所示。

圖5 Lineweaver-burk法求Km和Vmax

由圖5可知，直線回歸方程為y=4.028 9x+3.049 7，由此方程可求出Alcalase 2.4L FG催化小麥面筋蛋白水解反應(yīng)的米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率，即Km=1.321 1%，Vmax=0.327 9 mol/(L·h)。

2.2 可控酶解反應(yīng)機(jī)理的探討

由圖2和圖3可以看出，無論如何改變底物濃度和酶濃度，Alcalase酶解小麥面筋蛋白的水解進(jìn)程曲線都呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，即:在反應(yīng)初始階段，水解度的增加較快，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，水解度的增加變得緩慢，直至趨于恒定;同時(shí)，反應(yīng)速率也隨著時(shí)間的延長而快速下降，最后趨于0。分析引起這些現(xiàn)象的原因，主要包括以下幾方面因素:

(1)底物-產(chǎn)物抑制。從圖2可知，對(duì)于相同的底物濃度，當(dāng)加酶量不同時(shí)，相應(yīng)的水解度也不同，酶濃度越高，水解度越大。選加酶量為0.05%的情況為研究對(duì)象，在此條件下，酶解反應(yīng)進(jìn)行一段時(shí)間后，向體系補(bǔ)加一定量的相同濃度的新鮮底物蛋白溶液，發(fā)現(xiàn)水解度有所提高，如圖6所示，從而推測(cè)水解度增加變緩可能是由于體系中可被酶解的肽鍵的摩爾濃度降低所造成的;但另一方面，當(dāng)不補(bǔ)加底物而單純加大酶用量時(shí)，水解度也呈現(xiàn)增大趨勢(shì)，這就說明水解度增長速度減慢并不單純是被底物中可被酶解的肽鍵的量不足所限制的，而是另有原因，即存在底物－產(chǎn)物抑制現(xiàn)象。

圖6 補(bǔ)加底物后的酶解進(jìn)程曲線

從圖7可以看出，對(duì)酶解反應(yīng)的初始速率而言，當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀谀骋粷舛戎禃r(shí)，反應(yīng)速率隨底物濃度的增加而增加，這種情況發(fā)生在酶尚未被底物飽和之前;而當(dāng)?shù)孜餄舛雀哂谶@一濃度值時(shí)，反應(yīng)速率會(huì)隨底物濃度的繼續(xù)增加而降低，這是由于酶在被飽和后又被高濃度的底物抑制了的緣故。如圖1和圖2所示，各種酶解條件下的酶解進(jìn)程曲線都在反應(yīng)一段時(shí)間后達(dá)到緩慢上升直至趨于恒定的趨勢(shì)，這可能是由于隨著反應(yīng)的進(jìn)行，生成的產(chǎn)物與酶發(fā)生可逆或不可逆結(jié)合從而表現(xiàn)出抑制作用的結(jié)果。

圖7 小麥面筋蛋白酶解的M-M圖

(2)酶失活。在酶解反應(yīng)進(jìn)行一段時(shí)間后，向體系補(bǔ)加一定量的新鮮酶液，發(fā)現(xiàn)水解度明顯增加，如圖8所示;同時(shí)，從圖9中可以看出，在間歇酶解反應(yīng)中，酶活力在初始階段下降明顯，之后下降逐漸變緩;上述現(xiàn)象都說明，在小麥面筋蛋白酶解過程中，存在酶失活的因素。

圖8 補(bǔ)加酶后的酶解進(jìn)程曲線

圖9 Alcalase殘余酶活力隨時(shí)間的變化曲線

綜上所述，使得Alcalase催化小麥面筋蛋白酶解進(jìn)程曲線呈現(xiàn)出特定趨勢(shì)的主要因素包括底物－產(chǎn)物抑制及酶解過程中存在的酶失活現(xiàn)象，同時(shí)，這些原因也可用來解釋其它酶催化某種蛋白底物的酶解反應(yīng)。

3 結(jié)論

(1)根據(jù)酶動(dòng)力學(xué)的基本理論及推導(dǎo)，得到描述Alcalase 2.4L FG在溫度60℃、pH值9.0的條件下催化水解小麥面筋蛋白的動(dòng)力學(xué)方程，包括水解速率方程及水解度方程;經(jīng)驗(yàn)證，模型預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際測(cè)得的結(jié)果相當(dāng)一致，因此，該動(dòng)力學(xué)模型具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，可在實(shí)際中用來優(yōu)化指導(dǎo)生產(chǎn)，計(jì)算不同水解時(shí)間所對(duì)應(yīng)的水解度;還計(jì)算出米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率，結(jié)果為Km=1.321 1%，Vmax=0.327 9 mol/(L·h)。

(2)探討了由Alcalase 2.4L FG所催化的小麥面筋蛋白的可控酶解機(jī)理，找出了導(dǎo)致酶解進(jìn)程曲線呈現(xiàn)“先快速上升再趨于平緩最后趨于恒定”態(tài)勢(shì)的可能原因，包括底物－產(chǎn)物抑制及酶失活現(xiàn)象，這也可用來解釋由其它酶所催化的蛋白底物的酶解反應(yīng)機(jī)理，為更好地理解酶解過程提供科學(xué)依據(jù)。

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Study on the Mechanism and Kinetics Characteristics of Controlled Enzymatic Hydrolysis of Wheat Gluten

Cui Jie，Kong Xiang-zhen，Hua Yu-fei，Zhou Hui-ming
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and

Technology，Jiangnan University，Jiangsu，Wuxi 214122，China)

Wheat gluten was hydrolysed by Alcalase 2.4 L FG under the condition of 60℃and pH 9.0.The kinetics characteristics of wheat gluten were studied by discussing the influence of different substrate concentration and enzyme concentration on the degree of hydrolysis.Through the experiment，we not only established the kinetic models of both hydrolysis rate and degree of hydrolysis，but also discussed the critical substrate concentration and enzyme concentration，and simultaneously calculated the Michaelis constant Km=1.321 1%coupled with maximum reaction rate Vmax=0.327 9 mol/(L·h).It was found that the deviation between the theoretical value and actual value was very small，which indicated that the model has a good practical application value.Furthermore，the mechanism of controlled enzymatic hydrolysis was probed for a better understanding of intermittent hydrolysis reaction.

wheat gluten，Alcalase，hydrolysis，kinetics characteristics

碩士研究生(華欲飛為通訊作者)。

*國家863計(jì)劃基金(2008AA10Z312);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(JUSRP10919)

2010－01－14，改回日期:2010－06－12