周繼業(yè)，袁玉菊,顧佳寧，于 峰，田連福，朱俊林，李東屏*

(1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,中國 長沙 410081；2.湖南師范大學(xué)公共管理學(xué)院, 中國 長沙 410081)

植物體葉片的發(fā)育受基因[1-2]、環(huán)境[3]和激素[4]等因素共同調(diào)節(jié)．葉極性的建立直接決定葉的平展性發(fā)育，極性改變會(huì)破壞大多數(shù)植物葉的平展性，影響植物體的光合作用、蒸騰作用、呼吸作用[5]等生理功能．因此，參與葉極性建成的屬性基因或作用于激素信號(hào)途徑的基因發(fā)生突變,都會(huì)導(dǎo)致葉形態(tài)異常[6-7]．目前，國內(nèi)外科學(xué)家已從擬南芥等植物中分離出了一些發(fā)生葉卷曲的突變體，卷曲類型可分為，葉上卷(即偏下性生長),如hasty-5[8]；葉下卷(即偏上性生長)，如Icu[9]和葉片卷皺等．植物葉發(fā)育研究在最近幾年取得了較大進(jìn)展,許多葉發(fā)育相關(guān)的基因已經(jīng)被揭示出來[10-11], microRNA (miRNA)也參與了調(diào)控植物器官極性分化[12-13]，但有關(guān)葉發(fā)育分子調(diào)控的信號(hào)途徑仍不明了．lcd突變體是一個(gè)利用T-DNA插入誘發(fā)葉片發(fā)育異常的突變體，對(duì)其進(jìn)行遺傳分析和基因定位，為了解葉片極性或葉卷曲發(fā)生的遺傳規(guī)律，研究葉發(fā)育的調(diào)控機(jī)理都具有一定的理論意義．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

擬南芥 (Arabidopsisthaliana) 野生型為 Columbia (Co1) 生態(tài)型與Lansberg erecta (Ler)生態(tài)型，突變體為lcd突變體，突變體親本是Col生態(tài)型；rTaq DNA 聚合酶為 Ambiogen 公司產(chǎn)品；標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量Marker(DNA MarkerⅠ)為TIANGEN公司產(chǎn)品；寡核苷酸引物合成( PAGE 純化)及 DNA序列測定由上海生工公司完成．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 擬南芥突變體lcd的表型觀察 用數(shù)碼相機(jī)(SONY,DSC-S85)近距離拍攝植株整體形態(tài)或新鮮的離體器官；測量葉片長度和面積．

1.2.2 突變體的遺傳分析 將突變體種子播種于基質(zhì)為蛭石的營養(yǎng)土中，培養(yǎng)條件為溫度22 ℃，光照強(qiáng)度為120～150 umol/(m2.s)光培養(yǎng)16 h，暗培養(yǎng)8 h,濕度保持在60%～70%．培養(yǎng)至開花，以野生型Col為父本，lcd突變體為母本，進(jìn)行雜交，得F1種子．然后將F1種子種下，進(jìn)行自交，得F2種子．再將F2種子種于MS培養(yǎng)基上，生長一段時(shí)間以后檢測其性狀分離情況，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用于遺傳分析．

1.2.3 突變基因的初定位

(1)圖位克隆群體的構(gòu)建：把純合突變體與野生型Ler雜交，得到 F1代雜合體種子，將其種下觀察表型；然后，將F1代雜合體自交，得到F2種子；再F2種子播于培養(yǎng)土中，出現(xiàn)性狀分離，分單株提取DNA．

(2)初定位分子標(biāo)記的選擇：參照擬南芥信息資源網(wǎng)站 (TAIR) 上的相關(guān)信息，選用擬南芥中常用的簡單序列長度多態(tài)性 ( simple sequence length polymorphisms，SSLP ) 的分子標(biāo)記[14]，每條染色體上選擇分布較均勻的3～5個(gè)標(biāo)記，設(shè)計(jì)成引物，產(chǎn)物長度控制在100～200 bp左右，并且在擬南芥兩個(gè)野生型品種Ler與Col中呈共顯性．本文共選用22個(gè)分子標(biāo)記，設(shè)計(jì)成22 對(duì)引物進(jìn)行初定位(見表1)．

表1 粗略定位分子標(biāo)記

(3)DNA池的制備：分別取DNA 2 μL，每20株DNA混在一起制備成5個(gè)突變體DNA池，并以野生型Ler與Col為對(duì)照，用設(shè)計(jì)好的初定位分子標(biāo)記為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增．?dāng)U增條件為95 ℃變性3 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)45次，72 ℃ 10 min,22 ℃ 保存．

A, C, E為野生型，B, D, F為突變體圖1 lcd突變體的表型觀察

1.2.4 突變基因的精細(xì)定位 根據(jù)初定位的結(jié)果，在初定位染色體分子標(biāo)記區(qū)間內(nèi)逐步設(shè)計(jì)新的分子標(biāo)記，利用設(shè)計(jì)分子標(biāo)記的原則設(shè)計(jì)出精細(xì)定位的分子標(biāo)記，同時(shí)擴(kuò)大突變體的群體數(shù)量以單株突變體的總DNA為模板進(jìn)行PCR，縮小基因區(qū)間從而確定出突變基因的定位區(qū)間．

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體表型觀察與分析

突變體lcd與野生型表型有明顯的區(qū)別(圖1)．在幼苗期，從第一片真葉開始葉片向下卷曲(圖1B)，葉張角變大(圖1D)．在蓮座葉成熟后，突變體與野生型蓮座葉相比較，葉片尖端較鈍，基部較寬，葉柄較短，但葉片中部無明顯區(qū)別(圖1F)．

2.2 突變體的遺傳分析

F1代表現(xiàn)型與野生型Col完全一致，說明此卷曲突變?yōu)殡[性突變．而F2群體產(chǎn)生分離(見表2)，經(jīng)檢驗(yàn)，野生型(Col)與突變體lcd的分離比符合3∶1分離規(guī)律．同時(shí)將F1突變體lcd與野生型進(jìn)行回交，結(jié)果子代性狀分離比符合1∶1．因此，說明該突變體是隱性單基因突變體．

表2 突變體lcd的遺傳分析

2.3 突變基因的初定位

2.3.1 突變體的遺傳背景的純合檢測 用所設(shè)22對(duì)引物對(duì)突變體植株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果所有分子標(biāo)記都只擴(kuò)出一條Col的帶，說明此突變體的遺傳背景是純合的Col生態(tài)型(圖2)．

圖2 以突變體DNA為模板的22對(duì)分子標(biāo)記引物的PCR產(chǎn)物電泳分析

2.3.2 突變基因在染色體上的初步定位 F1代性狀都為野生型，但PCR結(jié)果均有兩條帶，故F1為雜合體．F2代出現(xiàn)性狀分離，分離出100株突變體植株，單株提取DNA，每20株DNA混在一起制備成5個(gè)DNA池，用于圖位克?。?/p>

以前面制備的5個(gè)DNA池、野生型Ler與Col作模板，進(jìn)行基因初定位，結(jié)果如圖3所示．

1～5:突變體的5個(gè)DNA池 C:野生型Col L:野生型Ler圖3 lcd突變體初定位電泳圖

在第3條染色體上的4個(gè)分子標(biāo)記位點(diǎn)中，分子標(biāo)記ATDMC1.1處，5個(gè)DNA池中有4個(gè)都只擴(kuò)增出Col型特有條帶，只有5號(hào)DNA池?cái)U(kuò)增出了Col和Ler的兩條帶．因此,可以推測突變基因位于第3條染色體上,與分子標(biāo)記ATDMC1.1緊密連鎖,但具體的方向還不清楚．

2.4 突變基因的精細(xì)定位

為了明確突變基因的方向，作者分別用分子標(biāo)記NGA162、ATDMC1.1和CIW4等3對(duì)單株突變體DNA進(jìn)行PCR，作圖群體數(shù)量為65個(gè)樣品，根據(jù)基因間的連鎖關(guān)系確定目的基因的方向．結(jié)果顯示在65個(gè)樣品中分子標(biāo)記NGA162只有3個(gè)樣品出現(xiàn)Col型特有的一條帶，其他都有Col和Ler的兩條帶．分子標(biāo)記ATDMC1.1在65個(gè)突變體植株中，共有59株只出現(xiàn)Col信息，有6個(gè)樣品既有Col信息，也有Ler的信息．分子標(biāo)記CIW4有35個(gè)樣品只出現(xiàn)Col信息，30個(gè)樣品既有Col信息，也有Ler的信息．根據(jù)結(jié)果可以確定lcd突變基因定位在ATDMC1.1和CIW4兩個(gè)分子標(biāo)記位點(diǎn)之間，且靠近ATDMC1.1這一側(cè)．

ATDMC1.1和CIW4之間相隔3 250 kb，作者在這兩個(gè)位點(diǎn)之間設(shè)計(jì)新的分子標(biāo)記CIW11(9 775 kb)、GAPAB(9 796 kb)和T27C7-SP6(13 047 kb)．然后分別用這3對(duì)分子標(biāo)記為引物以單株突變體的DNA為模板進(jìn)行PCR，作圖群體增加到了145個(gè)突變體植株，來確定該基因的大致位置．在這145個(gè)單株中，T27C7-SP6的重組子比較多，有59個(gè)重組子．CIW11和GAPAB的重組子很少，分別是5個(gè)和1個(gè)．再次擴(kuò)大作圖群體到500個(gè)突變體植株，對(duì)CIW11和GAPAB標(biāo)記進(jìn)一步鑒定．結(jié)果在這500個(gè)樣品中，CIW11的重組子有20個(gè)，而GAPAB的重組子只有5個(gè)(圖4)．因此，可初步推定該突變基因定位于擬南芥的第3條染色體上，且與分子標(biāo)記GAPAB緊密連鎖．

圖4 lcd 的精細(xì)定位圖

3 討論

lcd突變體的蓮座葉在橫向和縱向都出現(xiàn)不同程度的卷曲, 而且越在早期卷曲程度越大，到了葉發(fā)育的后期卷曲程度明顯變小，同時(shí)葉張角變大．向下卷曲是突變體lcd最明顯的特征．遺傳分析表明該突變?yōu)殡[性單基因突變．葉片在不同發(fā)育階段卷曲程度不同，這是lcd突變體最突出的特征；現(xiàn)在已報(bào)道的葉卷曲突變體[8-11]與lcd在表型上都存在差異．LCD基因突變不僅影響到葉型和葉片的極性生長，而且影響植物的株型(葉柄的張角)，暗示該基因在植物葉發(fā)育的兩類不同的信號(hào)通路中起作用．

目前，利用圖位克隆技術(shù)，已將突變基因初步定位于擬南芥的第3條染色體上，與分子標(biāo)記GAPAB緊密連鎖．根據(jù)http://www.arabidopsis.org網(wǎng)站上的基因信息對(duì)GAPAB標(biāo)記附近的一些基因進(jìn)行了仔細(xì)的分析．在GAPAB標(biāo)記附近作者查找到了11個(gè)基因，其中有兩個(gè)基因at3g26620、at3g26660都含有植物所特有的LATERAL ORGAN BOUNDARIES(LOB)Domain．已有研究表明，在雙子葉植物中，許多具有LOB-Domain的基因決定葉等側(cè)生器官的極性建立，并對(duì)側(cè)生器官的發(fā)育起重要的調(diào)控作用．根據(jù)突變體的表型特征，作者選定這兩個(gè)基因?yàn)榈谝缓蜻x基因，正在對(duì)這兩個(gè)基因做進(jìn)一步的功能分析，更進(jìn)一步的精細(xì)定位與基因克隆正在進(jìn)行中．

參考文獻(xiàn)：

[1] WAITES R, SELVADURAI HRN, OLIVER IR,etal. ThePHANTASTICAgene encodes a MYB transcription factor involved in growth and dorsoventrality of lateral organs in Antirrhinum [J]. Cell, 1998, 93: 779-789.

[2] KOYAMA T, FURUTANI M, TASAKA M,etal. TCP transcription factors control the morphology of shoot lateral organs via negative regulation of the expression of boundary-specific genes inArabidopsis[J]. Plant Cell, 2007, 19: 473-484.

[3] QI Y, SUN Y, XU L,etal. ERECTA is required for protection against heat-stress in the AS1/AS2 pathway to regulate adaxial-abaxial leaf polarity in Arabidopsis [J]. Planta, 2004, 219: 270-276.

[4] HAY A, BARKOULAS M, TSIANTIS M. ASYMMETRIC LEAVES1 and auxin activities converge to repressBREVIPEDICELLUSexpression and promote leaf development in Arabidopsis[J]. Development, 2006, 133(20):3 955-3 961.

[5] BOWMAN J L, ESHED Y, BAUMA S F. Establishment of polarity in angiosperm lateral organs [J]. Trends in Genetics, 2002, 18: 134-141.

[6] DENGLER N, KANG J. Vascular patterning and leaf shape [J]. Current Opinion in Plant Biology, 2001, 4:50-56.

[7] BERLETH T, SACHS T. Plant morphogenesis: long-distance coordination and local patterning [J]. Current Opinion in Plant Biology, 2001, 4: 57-62.

[8] TELFER A, POETHIG R S.HASTY: a gene that regulates the timing of shoot maturation inArabidopsisthaliana[J]. Development, 1998, 125: 1 889-1 898.

[9] WU H, YU L, TANG XR,etal. Leaf downward curvature and delayed flowering caused by AtLH overexpression inArabidopsisthaliana[J]. Acta Botanica Sinica, 2004, 46(9):1 106-1 113.

[10]IDAN E, EYAL B, ALEXANDER G,etal. A Protracted and dynamic maturation schedule underlies arabidopsis leaf development[J]. Plant Cell, 2008, 20: 2 293-2 306.

[11] GOLDSHMIDT A, ALVAREZ J P, BOWMAN J L,etal. Signals derived from YABBY gene activities in organ primordiaregulate growth and partitioning of Arabidopsis shoot apical meristems[J].Plant Cell, 2008, 20: 1 217-1 230.

[12] ESHED Y. Endogenous and synthetic microRNAs stimulate simultaneous, efficient, and localized regulation of multiple targets in diverse species[J]. Plant Cell, 2006, 18: 1 134-1 151.

[13] KRISZTINA N, THOMAS B, ALEXIS P,etal. The balance between the MIR164A and CUC2 genes controls leaf margin serration inArabidopsis[J]. Plant Cell, 2006, 18: 2 929-2 945.

[14]韋里俊，周繼業(yè)，陳 松，等.擬南芥錨蛋白ANK20基因表達(dá)模式[J].湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32(2)：89-92.