王 浩, 宋宏銳, 鄧英杰, 陳學(xué)思

(1. 沈陽藥科大學(xué) a. 藥學(xué)院; b. 制藥工程學(xué)院, 遼寧 沈陽 110016; 2. 中國科學(xué)院 長春應(yīng)用化學(xué)研究所 高分子化學(xué)與物理國家重點實驗室,吉林 長春 130022)

靜電紡絲是制備微米甚至納米級尺度纖維的一種方法，成纖維材料的選擇范圍很廣泛，所制得的纖維可作為無紡布進(jìn)行應(yīng)用[1，2]。由于電紡原理是粘性的高分子溶液在高壓電場作用下在細(xì)針尖部位形成Taylor錐，然后在較遠(yuǎn)距離的接收板上收集被拉長的細(xì)絲，所以該方法形成的纖維直徑多在5μm以下，有時甚至在100 nm以下，人們稱之為超細(xì)纖維。隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，超細(xì)纖維應(yīng)用在疾病的預(yù)防和治療上顯示良好前景，其可能作為手術(shù)后的填充和隔離材料。近十年來，將藥物包裹在纖維中作為藥物的控制釋放載體有越來越多的文獻(xiàn)報道[3～5]。

水溶性高分子纖維包裹藥物后在水性環(huán)境中會很快將藥物釋放完畢，起不到緩慢控制釋放藥物的作用所以應(yīng)用有限[2]。經(jīng)過嵌段親水基團(tuán)或共混改性后，水不溶材料亦可包裹水溶性藥物，但仍存在突釋行為[4]。為解決此問題，景遐斌等[6]提出乳化紡絲步驟將水溶性藥物包裹在水不溶性聚乙二醇-b-聚(L-乳酸)(1, Chart 1)材料管狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)腔，有效避免了藥物突釋，但是蛋白酶K(4)對纖維材料的降解會引起核心部位的藥物的耗竭，并且酶的濃度越高，藥物耗竭速率越快。在病理狀態(tài)時，機(jī)體的催化酶的生物活性可能會增加很多，比如炎癥感染部位的fibrinolysin表達(dá)會增多，導(dǎo)致酶活性的增高會使聚酯材料的降解加快，進(jìn)而加快耗竭藥物釋放載體中的藥物，所以開發(fā)一種較耐酶降解的藥物釋放裝置很有必要。

Chart1

最近，Trimaille等[7]合成了聚α-羥基辛酸(PHO), 其結(jié)構(gòu)如同將聚(L-乳酸)(PLLA)的甲基換成正己基，這樣會阻礙酶對其酯鍵的降解。由于己基鏈的空間阻礙作用，高聚合度PHO較難獲得[8], 而分子量較小的PHO由于在溶液濃度較低時粘度很低不能滿足成纖維的需要，在電紡時不能拉制成纖維。在PHO中嵌段聚乙二醇(PEG)，進(jìn)行親水性修飾合成低分子量的聚乙二醇-b-聚(α-羥基辛酸)(2, Chart 1),2作為添加劑進(jìn)入具有較高分子量1電紡纖維中以改善藥物釋放控制性能[9，10]。本課題組[11]曾經(jīng)將較小分子量的2摻入較高分子量的1纖維中，使其在高濃度酶條件下仍能保持纖維形態(tài)并能減緩釋藥速率。

本文采用油包水(W/O)乳化-電紡絲工藝(圖1)將阿霉素鹽酸鹽(3)包裹在纖維中形成核-殼狀纖維結(jié)構(gòu)，并且在高濃度蛋白酶K的作用下對其進(jìn)行降解，考察2是否能改善1對酶降解的耐受性以及是否影響3的釋放控制行為。

圖 1 W/O乳化-電紡絲工藝示意圖Figure 1 Schematic diagram of W/O emulsification-electrospinning technology

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

Model XL 30ESEM FEG from Micro FEI Philips型掃描電子顯微鏡(SEM)；Rigaku, D/max 2500V PC型廣角X-射線衍射儀(XRD);島津PU 980型高效液相色譜儀[Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×150 mm×5μm)，流動相：甲醇-乙腈-0.01 mol·L-1乙酸鈉溶液-冰醋酸(40 ∶10 ∶50 ∶1)，檢測波長：254 nm，流速:1 mL·min-1，柱溫：室溫，進(jìn)樣量：20μL];UV-975型紫外檢測器(UV)；Waters泵與Wyatt DAWN EOS(MALLS) DSP(RI)組合凝膠滲透色譜(GPC)； BRANSON Digital Sonifier?型空氣振蕩超聲器；靜電紡絲裝置(浙江東渚涂裝儀器廠)；HWY-103B型恒溫空氣浴搖床(智誠分析儀器制造有限公司,上海)。

L-丙交酯，Purac公司；3,6-二己基-1,4-二氧雜-2,5-二酮(辛交酯)按文獻(xiàn)[12]方法自制；3，純度98.7%，浙江海正集團(tuán)；4(Amesco)， Biotechnology Grade；聚乙二醇單甲氧基醚2000(MePEG 2000, Mw=2000)(5), Fluka公司；2-乙基己酸亞錫[Sn(OCt)2],純度>95%， Sigma公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)和甲苯，化學(xué)純，天津博迪化工有限公司；其余所用試劑均為分析純。

1．2 1和2的合成

聚合反應(yīng)在無水條件下進(jìn)行，并用氬氣充填反應(yīng)裝置。

在圓底燒瓶中加入50.6 g和甲苯50 mL,共沸除水12 h;蒸除剩余甲苯，殘余物在乙酸乙酯中重結(jié)晶，抽干。加入L-丙交酯30 g,于130 ℃磁力攪拌使其熔融，加入Sn(Oct)27 mg的無水甲苯(1 mL)溶液,開環(huán)聚合反應(yīng)24 h。移入氯仿(1 L)中，攪拌使其完全溶解后倒入冷乙醇中析出白色連續(xù)的絮狀結(jié)晶，擠出有機(jī)溶劑和細(xì)小殘渣；再溶解-析出，重復(fù)3次。于40 ℃真空干燥至恒重得分子量分布較窄的1。

在燥圓底燒瓶中加入辛交酯(用乙醚重結(jié)晶并真空抽干) 5.0 g,于110 ℃磁力攪拌20 min(揮干殘余的水分和有機(jī)溶劑)，加入5的THF溶液(0.6 g·mL-1) 5.0 mL和Sn(Oct)2的THF溶液(0.205 g·mL-1) 1.5 mL,于100 ℃磁力攪拌快速蒸發(fā)THF至熔融狀態(tài)，開環(huán)聚合反應(yīng)4 h。移入THF(30 mL)中，加入冷凍的正己烷200 mL,攪拌,析出聚合物;離心(3000 轉(zhuǎn)·min-1)分離，白色沉淀用冷正己烷混懸[除去殘留的辛交酯和Sn(Oct)2]；再離心分離-混懸，重復(fù)3次。于40 ℃真空抽干至恒重得白色粉末2。

GPC以氯仿為流動相測定1和2的質(zhì)均分子量Mw和多分散系數(shù)(PDI)，1: Mw=8.04×104g·mol-1, PDI=1.22;2: Mw=5.28×103g·mol-1, PDI=1.18。

1.3 乳液靜電紡絲

將3200 mg溶解于純凈水(5 mL)中制得水溶液(標(biāo)記為W-3)作為內(nèi)水相。

在容量瓶中加入1 1.50 g和CH2Cl210 mL,磁力攪拌12 h(溶液無色、透明、均一);加入SDS 75 mg,攪拌12 h(形成混懸液),用CH2Cl2定容使c(1)=60 mg·mL-1制得有機(jī)相(標(biāo)記為O-1)。加入W-31 mL,磁力攪拌2 h，超聲分散制得W/O型乳液,迅速進(jìn)行靜電紡絲制得核-殼狀結(jié)構(gòu)[13]纖維氈(標(biāo)記為F-1),

用類似方法制備纖維氈F-0(1 1.50 g), F-2(1 1.50 g, W-32 mL)和F-3(1 1.50 g,2150 mg, W-32 mL)。

靜電紡絲[14]：針頭與靜電發(fā)生器相連，接收屏接地并在其表面包蒙上鋁箔，使針頭噴絲口與鋁箔平面之間的距離即紡絲距離為50 cm，同時使得從直角型針頭滴出的乳液速度為2 mL·h-1～3 mL·h-1。開動高壓靜電發(fā)生器至5 000 V，在針頭和接收屏之間形成一個高壓電場，電紡絲開始。從噴絲口流出的紡絲液在電場力的作用下以高速不規(guī)則的螺旋軌跡運行，并被拉伸成為一定形狀沉積到接收屏上，在接受屏的后方用電暖氣對鋁箔上新紡出的成型材料中殘余溶劑進(jìn)行揮發(fā)，并確保接收板上的溫度為30 ℃左右。揭下接收平板上的橘紅色纖維氈，剪成小片備用。

1.4 纖維載藥量測定與藥物釋放曲線繪制

在混合溶劑A[V(DMF) ∶V(CH3Cl)=5 ∶4]中加入3，配制成梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，UV檢測，作藥物濃度[c(3)/g·L-1]-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。

將纖維氈(15 mg)溶解在混合溶劑A(10 mL)中,UV測其吸光度，查對圖2即可算出纖維氈的載藥量(%)(表1)。

c(3)/g·L-1圖 2 c(3)-吸光度(UV)標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 Standard curve of c(3) and absorbance by UV

表 1 纖維氈中3的載藥量Table 1 The drug loading amount of 3 in fibrofelts

磷酸鹽緩沖溶液(PBS, pH 6.8): 將磷酸鹽NaH2PO44.35 g和NaH2PO46.75 g溶解在去離子水，定溶至1 L。

將3溶解在PBS中，配制已知梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。HPLC測定，作c(3)-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。

c(3)/g·L-1圖 3 c(3)-峰面積(HPLC)標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 3 Standard curve of c(3) and peak area by HPLC

釋放介質(zhì): 在PBS中加入4，使4的濃度c(4)分別為2.5μg·mL-1, 5.0μg·mL-1, 10.0μg·mL-1。

將纖維氈[3 cm×2 cm×0.3 mm(15±2 mg)]浸入釋放介質(zhì)(50 mL)中，在預(yù)定時間(10 min， 1 h， 6 h， 12 h， 24 h， 48 h， 96 h， 168 h)取出纖維氈，HPLC測定浸過纖維氈的釋放介質(zhì);取出的纖維氈再浸入新的釋放介質(zhì)(50 mL)中,連續(xù)計時，重復(fù)操作。通過HPLC所測峰面積查對圖3可計算出各時間點的釋藥量并得出對應(yīng)的累積釋放百分率(Q=釋藥量/載藥量×100%)。

2 結(jié)果與討論

2.1 關(guān)于靜電紡絲

有機(jī)相中的SDS不僅是乳化劑同時也是一種導(dǎo)電物質(zhì)，所以本實驗在靜電紡絲過程中不再加入三乙基芐基氯化胺導(dǎo)電。

由于該W/O型乳為熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，在放置時間過長會出現(xiàn)含藥水層逐漸析出在乳液上層的現(xiàn)象，這樣單位時間內(nèi)乳液中乳滴的數(shù)目會逐漸減少，進(jìn)而導(dǎo)致在不同時間段纖維包裹的藥物量不均勻，嚴(yán)重時甚至?xí)霈F(xiàn)流出針頭僅為高分子溶液的現(xiàn)象，所以設(shè)定的紡絲速度即注射針頭中紡絲液的流出速度要快于單相溶液電紡的速度，使乳液在6 h內(nèi)紡絲完畢。與文獻(xiàn)[6]方法采用氯仿為有機(jī)相不同，本文采用CH2Cl2為有機(jī)相，由于氯仿比重大于CH2Cl2，乳液靜置時分層速度更快，而紡絲時間較長，所以采用分層較慢的CH2Cl2為有機(jī)相，并盡可能縮短紡絲時間，以獲得載藥均勻的纖維氈。

2.2 纖維形態(tài)和藥物包裹

纖維氈的SEM照片見圖4。從圖4可以看出，通過W/O乳化-靜電紡絲得到的纖維呈交織結(jié)構(gòu)，纖維直徑并不均勻，可能是由于內(nèi)水相小液滴在紡絲的過程中發(fā)生了聚合，或是由于W/O型乳劑在紡絲時表面張力變得不均一，從而使得纖維粗細(xì)不均。SEM未觀察到纖維表面析出顆粒狀物，即無3晶體析出。

圖 4 纖維氈的SEM照片F(xiàn)igure 4 SEM pictures of fibrofelts

2θ/(°)圖 5 樣品的XRD譜圖Figure 5 XRD spectra of samples

纖維氈的XRD譜圖(圖5)中未出現(xiàn)3的特征峰，說明乳化-紡絲過后纖維對藥物包裹良好。F-1的XRD譜圖與F-0相似；F-2在10°～25°有一較大的“饅頭峰”說明載藥量的增加使得這個角度范圍的衍射強(qiáng)度增加；F-3在此衍射角度無F-2的衍射強(qiáng)度，但是在20°～25°有兩個小尖峰，說明添加2抵消了“饅頭峰” 的出現(xiàn)，而小尖峰可能是由于2摻加進(jìn)入纖維中后對纖維的表面結(jié)晶形態(tài)產(chǎn)生了影響。

2.2 纖維中藥物的酶降解釋放

由表1可知，F(xiàn)-1(內(nèi)水相體積1 mL)的載藥量2.29%， F-2(W-3 2 mL)的載藥量4.33%，如果以W-3體積推算，F(xiàn)-2的載藥量應(yīng)為4.58%; F-2的實測載藥量低于推算值，原因可能是W/O乳液分層所致，本實驗制備的紡絲乳液為熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，由于紡絲時采用的外相(有機(jī)相)為固定體積，當(dāng)W-3體積由1 mL增加至2 mL時，其體積增多使液滴之間碰撞合并的可能性增加，引起分層；F-3的載藥量為4.48，高于F-1和F-2，可能是2的加入可防止W-3液滴合并。

纖維氈的藥物釋放曲線如圖6所示。4對3的釋放影響一般在較長的時間才會顯現(xiàn)，釋放5 min對應(yīng)的Q可以看成是纖維表面存在的結(jié)合不牢固的3的溶解情況，即如果藥物在纖維表面有析出，會產(chǎn)生突釋現(xiàn)象。實驗結(jié)果表明，F(xiàn)-1和F-2均未出現(xiàn)明顯突釋，即無論c(4)是多少，在10 min時都只有很小的色譜峰或幾乎檢測不到色譜峰，說明1較好包裹了3； F-3在10 min時有突釋(Q=10%)。這很有可能是由于2的摻入，使得纖維外殼的PEG鏈段密度相對較大，在紡絲時PEG可能溶解并在纖維固化后結(jié)合一些3，在F-3浸入釋放介質(zhì)時親水的PEG鏈段會使藥物突釋。

在5 min測得的釋藥量(突釋部分)可以作為考察載體對藥物包裹狀況的指標(biāo)，F(xiàn)-1和F-2在c(4)=0時，5 min幾乎測不到釋藥量，說明F-1對3有較好的包裹，在c(4)=2.5μg·mL-1時，5 min僅有微量釋放。無論c(4)是多少，F(xiàn)-3的釋藥量均為5%左右，其原因可能為2的親水鏈段比例較大，對3產(chǎn)生增溶作用，使其在釋放初期溶出量較大。

從總的釋放曲線形狀來看，2的添加并沒有明顯地影響F-3中3的釋放行為。三種纖維氈在24 h之內(nèi)的釋藥速度都較快，幾乎達(dá)到總載藥量的70%。分別來看，24 h后，有4存在的F-1釋藥量接近100%;c(4)=0時，4天后釋藥量亦達(dá)到80%。對于F-2，c(4)的大小不影響藥物釋放曲線的趨勢，只是在每個時間點，有4存在時，釋藥量略高；24 h后釋藥量達(dá)80%；4天后達(dá)85%。但是我們發(fā)現(xiàn)有4存在時，F(xiàn)-2在48 h后幾乎降解成細(xì)小碎片，由于3本身有一定的親脂性，其中有一部分已經(jīng)和纖維碎片中結(jié)合在一起沉淀在容器底部，造成沒有完全釋放的假象。F-3與F-2類似，即c(4)的大小不影響藥物釋放曲線的趨勢，在12 h前，c(4)=10μg·mL-1時，3的釋放速度較c(4)=2.5μg·mL-1或0都快，c(4)=2.5μg·mL-1或0的釋放量幾乎相同，12 h后c(4)=2.5μg·mL-1的釋藥量反而較c(4)=10μg·mL-1的多，其原因可能是高濃度酶的強(qiáng)烈降解作用使一部分2釋放進(jìn)入PBS中結(jié)合了一部分3，或者是由于纖維表面被強(qiáng)烈降解后裸露的2重新吸附了一部分3。

Time/h

超細(xì)纖維氈可以看成是固體分散體型藥物釋放系統(tǒng)，所以其中藥物釋放可以根據(jù)Higuchi方程[15]模擬。采用方程中釋放時間的算數(shù)平方根t1/2和Q進(jìn)行線性回歸。

盡管本實驗中材料對3的包裹類似將藥物作為內(nèi)芯包裹在[1+2]外殼中，但在纖維在固化過程中藥物會與高分子進(jìn)一步地融合而形成固體分散體結(jié)構(gòu)，小分子藥物如果分散在高分子載體中，釋放用偽Highchi方程來進(jìn)行擬合后會得到較好結(jié)果。

Weibull[16]擬合以lnt為橫坐標(biāo)，以lnln[1/(1-Q)]為縱坐標(biāo)作圖，進(jìn)行線性回歸得方程式和r2值(表2)。Higuchi擬合以t1/2為橫坐標(biāo)，以Q為縱坐標(biāo)作圖，進(jìn)行線性回歸得方程式和r2值(表2)。從表2可以看出，Higuchi擬合的方程斜率說明蛋白酶K的加入對于F-1來說有明顯促進(jìn)藥物釋放的作用，對于F-2和F-3來說雖然也增加了藥物的釋放但是斜率差遠(yuǎn)小于F-1的增加量，說明二倍載藥量紡絲得到的纖維中包裹的Dox分子在1中分配比例更高，同時也提示纖維外壁可能由于內(nèi)水相體積增大而變薄。此外，藥物釋放曲線也較符合Weibull擬合結(jié)果。

F-3在pH 6.8的PBS中降解4天，取出，用去離子水清洗，凍干，觀察其表面形態(tài)，SEM照片見圖7。由圖7可見，c(4)=0時，纖維表面仍然光滑;當(dāng)c(4)=2.5μg·mL-1時,纖維表面出現(xiàn)了小的凸點,這可能是1和2在酶作用下發(fā)生了相分離所致;與單相溶液紡絲不同的是，乳化紡絲的纖維在c(4)10μg·mL-1時,纖維表面也有凹凸不平的現(xiàn)象出現(xiàn),不似單相溶液在高濃度酶的時候表面光滑。

表 2 纖維氈在PBS中的3釋放曲線的Higuchi和Weibull擬合*Table 2 Higuchi and Weibull fitting of 3 from fibrofelts in PBS

*根據(jù)HPLC測定結(jié)果擬合

c(4)=0 μg·mL-1 c(4)=2.5 μg·mL-1 c(4)=10.0 μg·mL-1圖 7 在PBS中降解4 d的F-3的SEM照片F(xiàn)igure 7 SEM pictures of F-3 in PBS degradation for 4 days

3 結(jié)論

本文采用W/O乳液-靜電紡絲法成功制備得到添加聚乙二醇-b-聚(α-羥基辛酸)的內(nèi)芯含3的聚乙二醇-b-聚(L-乳酸)超細(xì)纖維(F-3), F-3具有耐酶降解的特性，在高濃度酶[c(4)=10μg·mL-1]的釋放介質(zhì)中降解7天，纖維仍能保持連接的狀態(tài)。聚乙二醇-b-聚(α-羥基辛酸)的摻入使得纖維氈耐受高濃度酶的降解,且對3的釋放行為幾乎沒有影響。將分子量較小的非降解性聚合物摻入到可生物降解的分子量較大的高分子中進(jìn)行紡絲后所得到的纖維便有耐受酶降解的作用，并且對包裹在其中的藥物釋放行為不產(chǎn)生影響。而不必將該種分子嵌段到形成載體材料的主要高分子中，因為對材料進(jìn)行改性時，物理摻雜相對于化學(xué)聚合反應(yīng)來說畢竟較為簡單。此實驗現(xiàn)象提示并再一此證明聚α-羥基辛酸對酶的降解有耐受作用，如果將辛交酯中的一個羥基辛酸置換成乳酸或乙醇酸再開環(huán)聚合制備得到的聚合物，其降解性能又將如何，其作為摻雜材料會有什么新的應(yīng)用價值等是值得進(jìn)一步研究的。

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