陳培華 張 威 陳 鵬 周子予 劉清君 王 平

(浙江大學 生物傳感器國家專業(yè)實驗室，生物醫(yī)學工程教育部重點實驗室，生物醫(yī)學工程與儀器科學學院 杭州 310027)

引言

迄今為止，人們知道有五種基本的味覺感受:酸、甜、苦、咸和鮮味，以為了動物能夠避免食物腐敗，獲取能量，避免有毒物質，維持體內離子動態(tài)平衡以及品嘗到美味。初級的味覺感受器為舌上皮中的味覺感受細胞。根據細胞的超微結構特征，哺乳動物的味覺細胞可以分為四類:Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和IV型。由于Ⅰ型味覺細胞為支持細胞，而Ⅳ型細胞為前體細胞，在味覺細胞的生命過程中不斷分化為其他類型的味覺細胞，這兩類細胞不能產生動作電位，且在味覺感受中的作用目前還不清楚，因此Ⅰ型和Ⅳ型細胞不是本工作的研究重點。甜味受體 (T1R2/T1R3)［1］、苦味受體 (T2Rs)［2］和 鮮味受體 (T1R1/T1R3，mGluR4)［3－4］分別表達于不同群的Ⅱ型細胞中。而Ⅲ型細胞中表達了酸味受體，如ASIC 通道［5］和 /或 PKDL［6］通道。它們分別在相應的味質刺激下，Ⅱ型和ⅢI味覺細胞都能發(fā)放動作電位?？墒茄芯孔C明Ⅱ型細胞與輸入神經沒有經典的突觸連接，Ⅲ型細胞是唯一一種與輸入神經纖維有突觸連接的味覺細胞。于是，綜合最新的生物分子學、免疫組化、膜片鉗電生理、在體神經記錄和動物行為學等研究進展，得到假設的味覺敏感傳導模型:IⅠ型細胞在苦甜鮮味味質的刺激下，產生動作電位，并釋放ATP到Ⅲ型細胞;Ⅲ型細胞在酸味味質的刺激下，或是接受Ⅱ型細胞釋放的ATP的刺激下，產生動作電位，并釋放5-HT到輸入神經纖維，然后將味覺信息傳遞到大腦［7］，如圖1(a)所示。

對味覺細胞在味質刺激下的電生理記錄有膜片鉗全細胞記錄 (whole-cell)、細胞貼附式記錄(cell-attached)以及非緊密封接的細胞貼附式膜片鉗記錄 (loose-patch)［8］。由于傳統(tǒng)的膜片鉗記錄操作復雜且對細胞有損傷，不利于對細胞放電模式的長時間記錄，于是衍生出非緊密封接的膜片鉗記錄方式。同時，由于胞內電位以及跨膜電流也能通過胞外電位反映。于是采用 LAPS芯片，對味覺細胞的胞外電位進行記錄。這是一種無損的、長期的記錄方式，能對味覺細胞在味覺刺激下的時域放電模式做較長時間記錄。本研究加工制作的LAP芯片以及LAPS測試系統(tǒng)如圖1(b，c)所示。

目前對味覺細胞在味質刺激下釋放的神經遞質5-HT的記錄是采用生物傳感細胞 (biosensor cell)［9］。即是采用細胞系HEK293或CHO細胞，將5-HT受體以及下游分子轉入該細胞中，并載入Ca2+敏感染料。在味質刺激下，胞內 Ca2+濃度升高，采用熒光顯微鏡，記錄響應的 Ca2+信號變化，從而反映有5-HT的釋放?？墒窃摲椒ǖ娜秉c是需要將生物傳感細胞培養(yǎng)在離味覺細胞很近的位置，才能使得釋放的5-HT被傳感細胞捕捉到。利用LAPS芯片可尋址的優(yōu)點，可將激光光點照射到芯片上任意一點做記錄。在LAPS芯片上附著一層約200 μm厚的對5-HT敏感的PVC膜，從而對味覺細胞組織釋放的5-HT進行檢測。

本研究中，用LAPS對單個味覺細胞在味質刺激下的胞外電位做記錄，并利用主成分分析法分析不同類型的味覺細胞的時域響應;并在LAPS芯片上沉積5-HT敏感的PVC膜，對味質刺激下，味覺細胞釋放神經遞質5-HT進行記錄，測試在酸味或是苦甜鮮味味質刺激下是否有5-HT釋放。實驗發(fā)現(xiàn)LAPS芯片為味覺細胞味覺敏感和傳導的研究提供了一種潛在的新方法。

圖1 味覺傳導模型，LAPS芯片及其測試系統(tǒng)。(a)味覺細胞信號傳導模式;(b)加工的 LAPS芯片;(c)LAPS測試系統(tǒng)Fig.1 The transduction model of taste sensation，LAPS chip and its measurement system.(a)taste signal transduction model;(b)the fabricated LAPS chip;(c)LAPS measurement system

1 實驗方法

1.1 LAPS芯片及其檢測系統(tǒng)

采用電解液-絕緣層-半導體(EIS)結構的LAPS芯片。選擇電阻率為10～15 Ω·cm的N型硅片。在1000℃ 熱生長一層30 nm的SiO2，然后利用等離子增強化學氣相沉積(PECVD)一層厚為60 nm的Si3O4。在基底背面再濺射一層1 μm的鋁作為歐姆接觸。鉑絲作為參考電極。LAPS檢測系統(tǒng)如圖1(c)所示，利用波長為543.5 nm，調制頻率為4 kHz(由鎖相放大器控制)的激光照射在 LAPS表面，其光點直徑約為10 μm。掃描I-V曲線，取斜率最大的點作為記錄胞外電位時的工作電壓。味覺細胞在味質刺激下的胞外信號耦合在工作電壓上，并最終被LAPS記錄到，產生與胞外電位成比例的光生電流。通過恒電位/電流儀(EG＆G Princeton Applied Research，Model 273A)自帶的電極電路檢測出LAPS光生電流并轉換成電壓，經過前置放大器及模擬濾波器進行信號的放大和預處理，由16位PCI6035數(shù)據采集卡和LabVIEW軟件控制數(shù)據的采集、分析和存儲。

1.2 味覺細胞培養(yǎng)和舌上皮制備

選擇SD大鼠舌上皮的輪廓狀乳頭部分，取輪廓狀乳頭并置于半胱氨酸 (1 mg/mL)激活的木瓜蛋白酶緩沖液中(14 U/mL，無二價離子)，浸泡約為3 h(環(huán)境37℃，5%CO2，95% 空氣)。取舌上皮，這樣得到結構松散的舌上皮，如果細胞有神經遞質釋放，便容易流出且被LAPS芯片檢測到。

在對單個味覺細胞的胞外電位檢測時，我們將上面步驟得到的味覺組織置于胞外液中，抖動味覺組織，味覺細胞便從舌上皮中脫離，并培養(yǎng)在用Cell-TAK處理過的LAPS芯片上。在測試前，味覺細胞培養(yǎng)在 DMEM中 2 h(環(huán)境37℃，5%CO2，95%空氣)。

1.3 5-HT敏感膜制備

筆者在LAPS表面沉積一層對5-HT敏感的PVC膜，其成分包括離子交換劑 KTPClPB(0.5 mg)、溶劑調節(jié)劑 Tris(2-ehylhexyl)phosphate(60 mg)、PVC(30 mg)，溶于 1 mL 四氫呋喃中［10］。取該混合溶劑約7～8 μL滴在 LAPS芯片上，等溶劑在室溫下蒸發(fā)后，在LAPS芯片上留下一層對5-HT敏感的PVC膜，約為200 μm厚。之后，用1 mM的5－HT溶液對此膜進行過夜活化。

2 實驗結果

2.1 胞外電位檢測

利用可尋址電位傳感器(LAPS)對味覺感受細胞在味質刺激下的電信號和化學信號進行記錄。在測量前將味覺細胞先培養(yǎng)2 h，在臺式液中，掃描I-V曲線，并將工作點電位設在I-V曲線上斜率最大的點并保持不變。如圖2(a)所示為Ⅱ型細胞在苦甜鮮混合刺激下 (MgSO4，蔗糖，谷氨酸)，Ⅲ型細胞在酸味刺激下(HCl)產生的時域放電。在酸味(pH=4)刺激下，味覺細胞的放電頻率為(2.9±0.3)Hz(n=14);在混合刺激下，味覺細胞的放電頻率為(2.54±0.32)Hz(n=10)(圖2(b))。當使用相同的味質(選取酸)，不同濃度刺激下，放電頻率則隨著濃度的改變如圖2(c)所示。在臺式液環(huán)境中時 (pH=7.5)，味覺細胞有少許自發(fā)放電，放電頻率為(1.35±0.14)Hz(n=14);pH=4時，放電頻率為(2.9±0.3)Hz(n=14);當 pH=2時，放電頻率為(3.8±0.65)Hz(n=12)。采用主成份分析法 (PCA)對不同味質刺激下的時域放電響應分析表明來自于不同種類細胞的響應形成了不同的簇，如圖2(c)所示。正方形為酸響應，三角形為苦甜鮮響應。

2.2 5-HT檢測

用不同濃度的5-HT溶液對該膜的特性進行測試。在不同濃度5-HT的情況下，記錄IV曲線，它們會有一定程度的平移，如圖3(a)所示。線性擬合得到靈敏度為19.1 mVp5-HT(r=0.997)。LASP芯片上的舌上皮如圖3(b)所示。之后，對舌上皮分別施加酸味刺激 (圖3(c))和苦甜鮮混合刺激 (圖3(d))，發(fā)現(xiàn)Ⅳ曲線有不同程度的平移，其平移約為30～100 mV。

3 討論和結論

LAPS芯片對味覺細胞在不同味質刺激下的電信號進行檢測。對味覺細胞在不同味質刺激下得到的放電頻率統(tǒng)計，結果得到放電頻率相差不大，表明不同味質不能簡單的由味覺細胞的放電頻率表示和編碼。但是，在相同味質不同濃度刺激下，放電頻率隨著濃度的增大而增大，揭示對味質濃度的編碼可能依賴于參數(shù)放電頻率。對味覺細胞在味質刺激下的時域放電模式進行PCA分析，結果表明:由Ⅱ型和Ⅲ型細胞的時域放電響應能夠將不同類型味覺細胞所攜帶的味覺信息分別出來。

LAPS芯片對味覺細胞在味質刺激下釋放的5-HT進行檢測，發(fā)現(xiàn)在味質刺激前后，I-V曲線有不同程度的右移，大約在30～100 mV。通過 LAPS芯片對5-HT響應特性分析，得到味覺細胞釋放的5-HT局部濃度大約為10－10－10－7M量級，與 Huang等人利用Ca2+熒光檢測方法得到的結果一致［9］。

圖2 味覺細胞在味質刺激下的時域放電。(a)味覺細胞在臺式液時、酸刺激下和混合刺激 (苦甜鮮)下的時域放電模式;(b)在酸刺激和混合刺激下的放電頻率;(c)隨pH降低，放電頻率增加;(d)對酸和混合刺激下的時域放電的主元分析PCA，酸和混合刺激分別聚集為兩簇，正方形:酸刺激;三角形:混合刺激Fig.2 Firing patterns of taste cells upon taste stimuli in time-domain.(a)Thefiringpatternsundertyrode solution，sour stimuli and mix stimuli(bitter，sweet and umami);(b)The firing rate with sour stimuli and mix stimuli;(c)The firing rate increases with pH decreasing;(d)PCA analysis of firing patterns upon sour and mix stimuli from time-domain.It forms two distinct cluster with sour and mix stimuli.Square:sour stimuli;Triangle:mix stimuli

通過LAPS芯片對味覺細胞在味質刺激下電信號和化學信號的胞外記錄，得到味覺細胞在味質刺激下會產生動作電位，味覺細胞在不同味質刺激下的放電頻率難以用來分辨味質，但味覺細胞在同種味質刺激下放電頻率與味質濃度成正比，不同類型的味覺細胞的響應通過時域放電模式是能分辨的;另一方面在味質刺激下，味覺細胞會釋放5-HT，與文獻結果一致。神經遞質5-HT的釋放與味覺信息的傳遞可能相關。另外，LAPS胞外記錄方法為味覺細胞的味覺感受等提供了一種無損的新穎記錄方式。

圖3 在味質刺激下舌上皮中味覺細胞釋放的5-HT記錄。(a)在各個5-HT濃度下LAPS芯片的響應;(b)鏡下LAPS芯片上的舌上皮;(c)在酸味刺激前后記錄的I-V曲線;(d)在苦甜鮮混合刺激前后記錄的I-V曲線Fig.3 The detection of released 5-HT from taste epithelium upon taste stimuli.(a)The response of LAPS chip to 5-HT with different concentrations;(b)The taste epithelium under microscope;(c)I-V curves before and after sour stimuli;(d)I-V curves before and after mix stimuli

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