謝伏霞，劉圣林，陳珂珂，朱澤瑞，李國(guó)林，印大中

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蛋白質(zhì)化學(xué)與發(fā)育生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410081)

在能量代謝或種種應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)的生物分子往往會(huì)遭遇氧應(yīng)激或糖應(yīng)激．這些應(yīng)激的水解產(chǎn)物主要有丙二醛(malondialdehyde, MDA)、4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)或甲基乙二醛(methyglyoxal)等不飽和毒性羰基類(lèi)物質(zhì)(reactive carbonyl substances，RCS)．這些不飽和羰基類(lèi)物質(zhì)具有廣泛的生物活性，在生理pH條件下能進(jìn)一步與含氨基的生物大分子(如: 神經(jīng)遞質(zhì)、蛋白質(zhì)、核苷酸等)自發(fā)反應(yīng)，造成它們的結(jié)構(gòu)改變和功能喪失，進(jìn)而導(dǎo)致一系列與衰老和疲勞相關(guān)的損變或老年退行性疾病．如:冠心病、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞和自身免疫性疾病等．另外，體內(nèi)的這些不飽和毒性羰基類(lèi)物質(zhì)還是谷胱甘肽下降、細(xì)胞膜損壞、酶功能抑制、免疫混亂、遺傳變異、細(xì)胞復(fù)制受阻等病理變化的重要原因和主要測(cè)定指標(biāo)[1]．現(xiàn)有的研究和文獻(xiàn)報(bào)道大多側(cè)重在對(duì)于血清或血漿和機(jī)體組織樣本中RCS的測(cè)定[2-3]．尿液是高等動(dòng)物體內(nèi)最重要的內(nèi)循環(huán)代謝產(chǎn)物，同時(shí)也是最易被受檢者接受的可以無(wú)損采集的樣本．尿液中含有能全面系統(tǒng)地反映生物體健康狀況的信息，但目前對(duì)尿液中RCS的測(cè)定方法仍較為繁瑣，例如最常用的硫代巴比妥酸反應(yīng)物法(TBARS法)或稱TBA法[4]．TBA法或與之配套的熒光檢測(cè)為了追求檢測(cè)靈敏度而采用煮沸反應(yīng)液，并對(duì)煮沸產(chǎn)生的大量蛋白質(zhì)沉淀物需進(jìn)行有機(jī)溶劑抽提等操作，造成了許多繁瑣的操作過(guò)程和誤差源頭．例如，1)反應(yīng)中的煮沸反應(yīng)過(guò)程容易造成鐵離子或銅離子誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和蛋白質(zhì)羰基的離解反應(yīng)；2) 也容易造成溶液沸騰汽化而操作失誤；3)尤其是需要配置較昂貴的儀器設(shè)施等，不便社區(qū)醫(yī)院等基層單位展開(kāi)簡(jiǎn)單快速地大樣本檢測(cè)．本文研究并介紹一種新的RCS-585 方法，本方法的反應(yīng)過(guò)程無(wú)需煮沸(只需45 ℃水浴)，操作簡(jiǎn)便，無(wú)需雙液相抽提離心操作，對(duì)MDA和4-羥基烯醛特異性高，反應(yīng)物穩(wěn)定性好，方法學(xué)檢驗(yàn)和臨床應(yīng)用都獲得了令人滿意的結(jié)果．

1 實(shí)驗(yàn)原理

一分子RCS，如MDA或4-HNE可與二分子N-甲基-2-苯基吲哚(N-methyl-2-phenylindole)在輕微加熱的條件下反應(yīng)生成穩(wěn)定的紫藍(lán)色物質(zhì)，這些物質(zhì)在585 nm處有最大的吸收峰，在分光光度計(jì)上讀取585 nm處的吸光值，從而可以計(jì)算RCS的含量．

MDA，R=OH；4-hydroxyalkenal，R=hydroxyalkyl

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 儀器與試劑

(1)儀器: Lambda Bio45紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)PE公司)；Milli-Q Academic A10超純水器(美國(guó)Millipore公司)；電熱恒溫水浴鍋(北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；旋渦混合器(海門(mén)麒麟醫(yī)用儀器廠)．(2) 試劑：N-甲基-2-苯基吲哚(生化試劑，北京成宇化工有限公司)；1,1,3,3,-四甲氧基丙烷(1,1,3,3-tetramethoxypropane, TMP；Sigma-aldrich公司，美國(guó)，purity=99%，d=0.997)；甲磺酸(methanesulfonic acid，F(xiàn)luka公司,ρ=1.481 g/mL，Assay Spec≥99.0%)；乙腈(分析純，湖南師大化學(xué)試劑廠)；甲醇(分析純，湖南師大化學(xué)試劑廠)．

2.2 測(cè)定方法[5]

(1)樣品：收集晨尿中段．(2)配制N-甲基-2-苯基吲哚反應(yīng)液：精密稱取0.015 5 g N-甲基-2-苯基吲哚，溶于7.5 mL的乙腈，含量即為10 mmol/L，然后和甲醇溶液按體積比V(N-甲基-2-苯基吲哚溶液)∶V(甲醇)= 3∶1的比例混合，即為N-甲基-2-苯基吲哚反應(yīng)液．(3)樣品測(cè)定：取澄清尿液0.60 mL(空白管以超純水代替)，加入1.95 mL的N-甲基-2-苯基吲哚溶液，漩渦振蕩3～4 s，再加入0.45 mL的甲磺酸(15.4 mol/L)，充分混勻后，將反應(yīng)體系置于45 ℃的水浴鍋中反應(yīng)40 min，反應(yīng)完畢后，取出放到冰浴上冷卻，于585 nm處測(cè)定吸光值．(4)毒性羰基類(lèi)物質(zhì)含量按下式計(jì)算.

C(mol/L) = (A-A0)×5/ε,

其中，A為樣品的吸光值；A0為空白管的吸光值；5為樣品稀釋倍數(shù)；ε是摩爾消光系數(shù)，其值為1.1×105mol-1·L·cm-1．

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析．先對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，繪制散點(diǎn)圖．

3 結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)條件選擇

3.1.1 加熱溫度與反應(yīng)時(shí)間的影響 用上述方法，采用兩因子五水平的試驗(yàn)，考察加熱溫度與反應(yīng)時(shí)間兩個(gè)因子對(duì)MDA溶液(濃度分別為30、40、50 μmol/L)和兩個(gè)尿液樣本測(cè)定的影響．結(jié)果表明：以溫度45 ℃、時(shí)間40 min為臨界點(diǎn)，在溫度0～45 ℃，時(shí)間0～40 min內(nèi)吸光值均隨變量X的增加而增加；45 ℃、40 min以后吸光值基本恒定(見(jiàn)圖1、2)．

圖1 加熱溫度對(duì)吸光值的影響(注：固定反應(yīng)時(shí)間為40 min；n=3；585 nm檢測(cè))

圖2 加熱時(shí)間對(duì)吸光值的影響(注：固定反應(yīng)溫度為45 ℃；n=3；585 nm檢測(cè))

這表明在45 ℃下反應(yīng)40 min是該測(cè)定方法最佳的反應(yīng)條件．

3.1.2 離心操作對(duì)測(cè)定的影響 測(cè)定方法同前．隨機(jī)取7個(gè)尿樣，每一樣品分為2份，一組加熱冷卻后直接測(cè)定吸光值，另一組在15 000 g下離心10 min后取上清液測(cè)定吸光值，結(jié)果見(jiàn)表1．

表1 離心處理對(duì)吸光值的影響

對(duì)上面2組測(cè)定結(jié)果的平均數(shù)進(jìn)行配對(duì)數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)，得：t=1.646，P>0.05，n=7；表明未離心組與離心組之間的差異不顯著．故加熱冷卻后可以直接進(jìn)行測(cè)定，無(wú)需過(guò)濾．

綜上所述，本方法的最佳實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)為：尿樣0.6 mL，N-甲基-2-苯基吲哚溶液1.95 mL，甲磺酸0.45 mL，在45 ℃水浴鍋中反應(yīng)40 min，冰浴冷卻后于585 nm處測(cè)定吸光值．

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(585 nm檢測(cè)；n=3)

于9支EP管中各加入TMP 0.60 mL，分別按濃度為0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5,15.0,17.5,20.0 μmol/L (3次重復(fù)), 再加入N-甲基-2-苯基吲哚溶液1.95 mL，按上述方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3．

圖3中可見(jiàn)，TMP濃度在20 μmol/L以下時(shí)曲線的線性關(guān)系配合良好，回歸方程為：Y=0.11X+0.03 (r=0.999 8；t=197.085，P>0.01)．

3.3 靈敏度

按照國(guó)際應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)的規(guī)定，化學(xué)檢測(cè)方法的置信水平應(yīng)達(dá)到99.86%．檢測(cè)方法學(xué)的置信水平由下式算出.

檢測(cè)極限=3δ空白/ 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，

式中δ空白為測(cè)定空白值的標(biāo)準(zhǔn)誤差．以雙蒸水調(diào)零，測(cè)定10個(gè)尿樣空白管 (各管均不加入N-甲基-2-苯基吲哚反應(yīng)液)，結(jié)果見(jiàn)表2．

表2 尿液樣本吸光值與標(biāo)準(zhǔn)差

表2的結(jié)果說(shuō)明采用本方法檢測(cè)，檢測(cè)極限為：0.013 655 μmol/L．靈敏度為：1-0.013 655=98.63%．

3.4 回收率

在兩份尿液樣品中分別加入不同濃度的TMP溶液，回收結(jié)果見(jiàn)表3．

表3 回收率實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表3的結(jié)果說(shuō)明，采用本方法測(cè)定平均回收率為102.57%．

3.5 精密度

對(duì)低、中、高3個(gè)樣品進(jìn)行6批測(cè)定，每批重復(fù)3次，結(jié)果如表4．

表4 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.6 正常人尿中RCS水平的參考范圍

采用上述方法測(cè)定了1 283例正常成年人尿液中的RCS水平，結(jié)果見(jiàn)表5和圖4．

表5 正常成年人(1 283例)尿液中的RCS含量

圖4 正常成年人(1 283例)尿液中RCS的分布情況

4 討論

4.1 尿液中RCS測(cè)定的意義

機(jī)體內(nèi)的氧應(yīng)激和糖應(yīng)激與衰老及許多重要疾病的病理有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系[6]．大量研究表明，不飽和毒性羰基類(lèi)物質(zhì)是脂質(zhì)過(guò)氧化物的水解產(chǎn)物，是自由基氧化過(guò)程中不可避免地產(chǎn)生的活性“生物垃圾”．在此類(lèi)研究中往往可通過(guò)檢測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的程度，即從應(yīng)激代謝或降解產(chǎn)生的二級(jí)或中期產(chǎn)物RCS入手．非酶糖基化也是造成類(lèi)似的生物活性垃圾RCS的重要應(yīng)激過(guò)程．這些RCS作為應(yīng)激中期產(chǎn)物一般能被機(jī)體識(shí)別和清除，而它們的長(zhǎng)期積累則會(huì)形成脂褐素(老年色素)和晚期糖基化高級(jí)產(chǎn)物．這些高級(jí)產(chǎn)物在生物體內(nèi)不可修復(fù)，難以去除，最終導(dǎo)致衰老和多種疾病如腫瘤、休克、心肌梗塞、動(dòng)脈粥樣硬化以及自身免疫性疾病等[7]．因此，監(jiān)測(cè)種種RCS，可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化和非酶糖基化的水平，也可作為體內(nèi)應(yīng)激性“垃圾”產(chǎn)物積累的信息指數(shù)，從而為判斷機(jī)體是否處于健康狀態(tài)提供依據(jù)．

尿液雖由腎臟產(chǎn)生，但與體內(nèi)的諸多系統(tǒng)及其狀態(tài)均密切相關(guān)．尿液中的成分受飲食、運(yùn)動(dòng)、情緒、機(jī)體代謝、人體內(nèi)環(huán)境及內(nèi)臟處理各種物質(zhì)的能力等因素的影響而改變．當(dāng)人體處于疲勞應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，其循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)等就會(huì)出現(xiàn)異常，進(jìn)而引起系統(tǒng)生物學(xué)指標(biāo)改變，代謝組學(xué)指標(biāo)異常，這些都使得尿液的質(zhì)和量發(fā)生改變，例如產(chǎn)生與疲勞應(yīng)激相關(guān)的各種不飽和醛酮類(lèi)和老年色素前體(ceroid)物質(zhì)的積累等，我們通過(guò)檢測(cè)尿液樣品中不飽和醛酮類(lèi)物質(zhì)來(lái)作為體內(nèi)應(yīng)激性產(chǎn)物積累的信息指數(shù)，進(jìn)而為判斷機(jī)體是否處于健康狀態(tài)提供依據(jù)．

另外，尿樣是從人體最容易取得，且對(duì)人體無(wú)損傷的樣本，若以它代替血清和組織樣本，應(yīng)用于自由基生物學(xué)、衰老生物化學(xué)研究工作、亞健康狀態(tài)和臨床疾病的診斷，將具有非常重要的意義．

4.2 RCS-585比色法與TBA反應(yīng)法的比較

RCS在生物體內(nèi)的含量，如MDA和4-HNE，常常是作為衡量氧化應(yīng)激和非酶糖基化水平的檢測(cè)指標(biāo)[8-9]．目前，對(duì)MDA的測(cè)定以TBARS法應(yīng)用最廣，雖有許多研究者對(duì)此方法進(jìn)行了改良[2-3,10-11]，但仍然存在其他幾個(gè)方面的缺陷：例如， 樣本需經(jīng)過(guò)酸加熱處理(60 min, 100 ℃)因而手續(xù)較復(fù)雜，預(yù)處理時(shí)間較長(zhǎng)，造成結(jié)果不夠穩(wěn)定；酸加熱過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生MDA, 從而學(xué)術(shù)界對(duì)檢測(cè)到的MDA 含量有不同的看法；生物體系中還含有其他能與硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)反應(yīng)的物質(zhì), 如膽紅素、唾液酸、糖類(lèi)等[12]，這些物質(zhì)都會(huì)或多或少干擾MDA與TBA反應(yīng)[13]．

本文所介紹的RCS-585比色法操作簡(jiǎn)便，無(wú)需加熱煮沸，不產(chǎn)生煮沸過(guò)程中可能發(fā)生的難于預(yù)知的當(dāng)場(chǎng)氧化或離解反應(yīng)，尤其是煮沸過(guò)程中因蛋白質(zhì)沉淀造成的實(shí)驗(yàn)誤差及相關(guān)萃取離心過(guò)濾的麻煩，避免了實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中的諸多干擾．

另外，此方法利用N-甲基-2-苯基吲哚與MDA和4-羥基烯醛發(fā)生特異性地反應(yīng)，反應(yīng)有較高的專一性，生成物在跟蹤觀察的數(shù)小時(shí)至一天內(nèi)均顯穩(wěn)定．根據(jù)相關(guān)研究，該反應(yīng)對(duì)于丙烯醛、甲基乙二醛不靈敏，對(duì)于己醛可產(chǎn)生在505 nm附近的最大吸收，均對(duì)本測(cè)定波長(zhǎng)585 nm無(wú)干擾．根據(jù)反應(yīng)原理及相關(guān)研究的結(jié)果亦可基本相信，在此溫度下，因?yàn)椴粫?huì)產(chǎn)生大量交聯(lián)性生化衍生物，其他生化物質(zhì)亦不會(huì)產(chǎn)生可觀的干擾[14]．

由于尿樣采集方便，而且容易獲取大量樣本，因此本方法取用0.60 mL尿樣(是常規(guī)血清樣本量的30倍)進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)而以可見(jiàn)光吸收比色就可以進(jìn)行簡(jiǎn)捷測(cè)定，而無(wú)須以通常應(yīng)用來(lái)提高檢測(cè)靈敏度的TBA熒光檢測(cè)方法，可節(jié)省實(shí)驗(yàn)室的人力、物力和財(cái)力．

盡管本方法的靈敏度較TBARS法略差，但根據(jù)作者對(duì)數(shù)以千計(jì)的人群樣本的測(cè)定，觀察到了尿液對(duì)代謝垃圾的明顯的富集現(xiàn)象，該富集現(xiàn)象對(duì)于應(yīng)激或亞健康狀態(tài)的人群尤甚，例如，感冒人群或睡眠剝奪人群尿液中的RCS含量(30～50 μmol/L)就大大高于正常人群血清中RCS的濃度(2～4 μmol/L)[2]．一般尿液中毒性不飽和醛酮的含量可高達(dá)血清含量的1～25倍，因而，本方法可以適用于科研和臨床上對(duì)于樣本量較大和濃度較高的樣本的檢測(cè)需求．

從另外一個(gè)角度來(lái)講，本研究以檢測(cè)可發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的生物毒性“垃圾”為檢測(cè)目標(biāo)，任何可能與反應(yīng)試劑產(chǎn)生交聯(lián)共軛的代謝“垃圾”，均為可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)和核酸等交聯(lián)變性的“毒性”物質(zhì)，均是造成“亞健康”生物變態(tài)的“罪犯”分子，一并捕獲該類(lèi)“嫌疑”分子是本研究的宗旨所在，也是結(jié)合中、西醫(yī)學(xué)各自的優(yōu)勢(shì)——還原分析合并歸納綜合思維——相得益彰的創(chuàng)新之處．作者認(rèn)為，此類(lèi)“歸類(lèi)檢測(cè)思維”應(yīng)該成為相關(guān)系統(tǒng)生物學(xué)研究很好的參照模式和思維創(chuàng)新模式，而非固守傳統(tǒng)的“專一性”檢測(cè)模式．

總之，此測(cè)定方法原理簡(jiǎn)單，反應(yīng)可靠，操作方便，快捷易行．在一定濃度范圍線性較好、回收率和精密度均較高，對(duì)設(shè)備和實(shí)驗(yàn)室條件要求低，便于推廣，適用于代謝應(yīng)激和亞健康相關(guān)的臨床及臨床前常規(guī)檢測(cè)．

致謝：本研究得到了湘雅健康管理中心生化檢驗(yàn)科諸多醫(yī)務(wù)工作者的幫助和指導(dǎo)，特此一并致謝．

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