譚年元,蔣 燕,肖小明 *,陳立新,顏煒偉,黃賽金

(1.湖南工程學院化學化工學院, 中國 湘潭 411104; 2.湖南師范大學化學化工學院, 中國 長沙 410081)

近年來，過渡金屬多吡啶配合物與DNA的相互作用已成為無機生物化學領(lǐng)域十分活躍的研究課題[1-6]．過渡金屬多吡啶配合物廣泛地被研究用作DNA結(jié)構(gòu)探針、DNA分子光開關(guān)、DNA光裂解試劑以及抗癌藥物等[1-4]．含配體dppz(dipyrido[3,2-a; 2′,3′-c ]phenazine, 二吡啶吩嗪)的多吡啶釕配合物[RuL2dppz]2+(L=2,2′-bipyridine, 1,10-phenanthroline)在有機溶劑中可產(chǎn)生熒光，而在水溶液中，由于配體與水分子存在氫鍵作用，從而猝滅了插入配體的激發(fā)態(tài)．當加入DNA后，配體dppz插入DNA堿基對中，吩嗪N受到保護而脫去締合水而又有熒光出現(xiàn)，此效應(yīng)稱為“光開關(guān)”[3-4]．

圖1 配體dpapz的結(jié)構(gòu)

為進一步研究該類配合物與DNA的鍵合性質(zhì)，吳寶燕等[7]合成了一種在dppz骨架上引入另一個氮原子的配體聯(lián)吡啶并[3,2-a: 2′,3′-c ]6-氮雜-吩嗪(dpapz，結(jié)構(gòu)如圖1所示)的多吡啶鈷配合物，他們發(fā)現(xiàn)該配合物與DNA鍵合作用較強，是一種良好的DNA嵌入鍵合試劑.本文合成了含該配體的多吡啶鈷配合物，并測定了配合物的電化學行為，以及分別采用紫外、熒光和黏度法研究了配合物與小牛胸腺DNA的相互作用．

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AVATAR-370紅外光譜儀(美國Nicolet公司)、Vario-EL Ⅲ元素分析儀(德國Elementar公司)、CHI660B電化學工作站(上海辰華儀器公司)、 Agilent-8453紫外可見分光光度計(美國Agilent公司)、F-4500熒光分光光度計(日立公司)、pHS-3C型精密酸度計(上海雷磁廠)、烏式黏度計．

[Co(bpy)2Cl2]Cl[8], dpapz[7]參照文獻方法合成，小牛胸腺DNA(北京華美生化試劑試劑公司)，三羥甲基氨基甲烷 (Tris) (日本和光純藥工業(yè)株式會社)，高氯酸四丁基銨( Fluka公司)．其它試劑均為AR級, 所用試劑除特別說明外均沒有進一步處理．

研究配合物與DNA相互作用時, 樣品均溶解在含5 mmol·L-1Tris·HCl和50 mmol·L-1NaCl的二次蒸餾水緩沖溶液(pH=7.2)中，小牛胸腺DNA的濃度以ε260=6 600 L·mol-1·cm-1來確定[9]．

1.2 配合物的合成

1.3 分析方法

1.3.1 電化學測定 配合物的電極電位用循環(huán)伏安法測定．采用三電極系統(tǒng)，工作電極為玻碳電極，使用前先用0.05 μm的Al2O3糊在拋光墊上拋光，然后依次在丙酮、二次蒸餾水中超聲清洗10 min，輔助電極為鉑電極，參比電極為飽和甘汞電極(SCE)．溶劑為乙腈，使用前用P2O5重蒸2次，支持電解質(zhì)為高氯酸四丁基銨(TBAP，0.1 mol·L-1)．測試前通高純氮15 min除氧．

1.3.2 配合物與DNA作用的電子吸收光譜 在參比池加入2.5 mL Tris緩沖溶液，在樣品池中加入相同體積的6 μmol·L-1的配合物溶液，用微量加樣器每次往參比池和樣品池中加入相同體積的DNA溶液，使DNA與配合物濃度比值不斷增加，直至吸收峰不再減色．

1.3.3 配合物與DNA作用的熒光光譜 在樣品池中加入2.5 mL 6 μmol·L-1的配合物溶液．用微量加樣器每次往樣品池中加入相同體積的DNA溶液，使DNA與配合物濃度比值不斷增加，以適當波長激發(fā)光激發(fā)，測定配合物的發(fā)射光譜．

1.3.4 DNA黏度測定實驗 溫度恒定在(28±0.1)℃，小牛胸腺DNA濃度固定為0.4 mmol·L-1，依次增大配合物濃度．相對黏度按公式η= (t-t0)/t0[t0為緩沖溶液流經(jīng)毛細管所需時間，t為DNA溶液(含濃度不等的鈷配合物)流經(jīng)毛細管所需的時間]計算[10]．以(η/η0)1/3對結(jié)合比率r作圖(r= [Co]/[DNA])，η0為未加配合物時DNA溶液的相對黏度．

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物的電化學性質(zhì)

配合物在乙腈中的循環(huán)伏安曲線如圖2所示．由圖2可知，在-0.1～0.7 V電位范圍內(nèi)，配合物有一對氧化還原峰，其陽極峰電位和陰極峰電位分別為Ep,a=0.415 V和Ep,c=0.266 V, 對應(yīng)的電極反應(yīng)是Co(Ⅲ)/Co(Ⅱ)的氧化還原過程．陽極峰電位和陰極峰的電位差ΔEp=0.149 V，其峰電流對掃描速率(0.02～0.2 V/s)的平方根作圖(圖2)，可得一條通過原點的直線，故認為該氧化還原反應(yīng)為準可逆單電子過程．

2.2 配合物與DNA作用的電子吸收光譜

配合物與DNA相互作用的電子吸收光譜如圖3所示．由圖3可知，隨著DNA濃度增加，配合物在221，274，307和368 nm處的吸收峰均發(fā)生明顯的減色，減色率分別為24.2%、35.6%、13.2%和37.0%，表明得到的配合物可能以插入方式與DNA鍵合[11]．這是因為插入配體與DNA堿基對發(fā)生π電子堆積之后，配體的π*空軌道與堿基的π電子軌道發(fā)生偶合，偶合后的π軌道因部分填充電子，使π→π*躍遷幾率減小，產(chǎn)生減色效應(yīng)．配合物與DNA的鍵合常數(shù)Kb可根據(jù)下列方程式求得[12]：

cDNA/(εf-εa)=cDNA/(εf-εb)+(1/Kb) (εf-εb)，

其中，cDNA表示DNA的濃度，εa、εb和εf分別表示任意DNA濃度下、鍵合飽和以及未加DNA時配合物的摩爾吸光系數(shù)，以cDNA/(εf-εa)對cDNA作圖(圖3)，所得直線的斜率與截距的比值即為配合物與DNA的鍵合常數(shù)Kb=1.49×105L·mol-1．

圖2 配合物[Co(bpy)2dpapz]3+在乙腈中的循環(huán)伏安曲線，掃描速率為100 mV/s 圖3 配合物[Co(bpy)2dpapz]3+在不同DNA濃度下的電子吸收光譜

2.3 配合物與DNA作用的熒光光譜

熒光光譜變化幅度的大小也能反映配合物與DNA作用的強度．以240 nm波長的光進行激發(fā)，測得配合物的熒光光譜如圖4所示．在Tris溶液中，配合物沒有熒光，這是由于配體dpapz與水分子之間存在氫鍵作用，從而猝滅了插入配體的激發(fā)態(tài)[7]．加入DNA后，配合物的插入配體dpapz插入DNA堿基對中，吩嗪N受到保護脫去締合水而產(chǎn)生發(fā)射波長為331 nm的熒光，且隨DNA濃度的增大，強度明顯增大，表明配合物與DNA作用較強，與紫外光譜結(jié)果一致．

2.4 配合物與DNA作用的黏度測定

黏度測定是確定配合物與DNA鍵合模式的最有效的方法之一．當配合物以靜電、溝面結(jié)合等非插入方式與DNA作用時，DNA溶液的黏度無明顯變化；當配合物通過經(jīng)典插入方式與DNA作用時，DNA相鄰堿基對的距離變大以容納插入配體，導致DNA雙螺旋伸長，DNA溶液的黏度增加；當配合物以部分插入方式與DNA作用時，則可能使DNA雙螺旋發(fā)生扭結(jié)，使DNA溶液黏度減小[10]．從圖5可知，隨著配合物濃度增加，DNA溶液的相對黏度增大，進一步證實該配合物是以經(jīng)典插入方式與DNA結(jié)合．

圖4 配合物[Co(bpy)2dpapz]3+隨DNA濃度增大的熒光光譜圖 圖5 DNA溶液的相對黏度隨配合物[Co(bpy)2dpapz]3+加入量的變化

3 結(jié)論

合成了一種新型多吡啶鈷配合物[Co(bpy)2dpapz](ClO4)3·H2O并對其進行了表征，用光學實驗和黏度測試研究了該配合物與DNA的互相作用，結(jié)果顯示該配合物以經(jīng)典的插入方式與DNA結(jié)合，鍵合常數(shù)為1.49×105L·mol-1．

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