楊 芳,王洪倫,李春婷,索有瑞＊

1中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所,西寧 810001;2中國(guó)科學(xué)院研究生院,北京 100049

白花龍膽花抗炎作用研究

楊 芳1,2,王洪倫1,李春婷1,2,索有瑞1＊

1中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所,西寧 810001;2中國(guó)科學(xué)院研究生院,北京 100049

為了研究白花龍膽花的抗炎作用,本文對(duì)白花龍膽花水提物和 70%乙醇提取物的抗炎活性進(jìn)行了試驗(yàn),并測(cè)定了水提物和 70%乙醇提物中龍膽苦苷的含量。試驗(yàn)采用二甲苯所致小鼠急性耳腫脹試驗(yàn)和二甲苯所致小鼠腹部毛細(xì)管通透性試驗(yàn)。將昆明種小白鼠分為 7組,分別為空白對(duì)照組,白花龍膽花水提物高、中、低劑量組和 70%乙醇提取物高、中、低劑量組,灌胃(ig)給藥 14 d后,用二甲苯分別于小鼠右耳及腹部致炎。測(cè)定左右耳重量,計(jì)算腫脹度及腫脹抑制率,測(cè)定吸光值。結(jié)果表明:白花龍膽花水提物和乙醇提取物的中、高劑量組對(duì)于二甲苯所致的小鼠急性耳腫脹和小鼠腹部毛細(xì)管通透性都有顯著的抑制作用。從而表明:白花龍膽花具有顯著的抗炎療效。

白花龍膽花;抗炎作用

白花龍膽是龍膽科(Gentianaceae)龍膽屬 (Gentiana ToumL.)植物麻花秦艽 (Gentiana stram inea Maxim.)的民間俗稱,藏醫(yī)稱“解吉嘎?！盵1],是我國(guó)重要的常用中藏藥材資源之一,已有 2000年的藥用歷史。麻花秦艽又名西秦艽、大秦艽、左秦艽、左扭根等,民間因其花的顏色為白色,將其稱為白花龍膽,作為傳統(tǒng)常用中藥,歷代本草皆有收載。其始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為中品[2]。根據(jù)報(bào)道,其根部的主要成份是裂環(huán)烯醚萜苷類:龍膽苦苷 (gentiopic roside)[3-5]、當(dāng)藥苦苷 (swerta marin)、當(dāng)藥苷 (s weroside)[6]。白花龍膽的根具有多種藥效。如祛風(fēng)濕、退虛熱、舒筋止痛的作用,用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、結(jié)核病潮熱、小兒疳熱、黃疸性肝炎、小便不利等癥[7]。

《中國(guó)藥典》2005年版將秦艽、麻花秦艽、粗莖秦艽和小秦艽 4種植物收載為中藥秦艽的基原植物,以根入藥。但在傳統(tǒng)藏藥中,麻花秦艽除根外,還以花入藥,即白花龍膽花。目前,對(duì)于白花龍膽的根的抗炎活性研究已有報(bào)道,但對(duì)于白花龍膽的地上部分,尤其是傳統(tǒng)藏藥中使用的白花龍膽花的抗炎活性及其它藥理活性未見報(bào)道,本文對(duì)白花龍膽花水提物和乙醇提取物的抗炎作用分別作了研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

白花龍膽花 70%醇提物的制備:本試驗(yàn)選用70%的乙醇作為提取溶劑,稱取白花龍膽花 1 kg,粉碎至 2～3 cm長(zhǎng),置于 20 L的燒瓶中,料液比為 1∶10,在 70℃水浴中加熱回流提取 3 h,重復(fù)兩次,提取液濃縮回收乙醇,最終濃縮得干物質(zhì) 292 g,70%乙醇提取物每克相當(dāng)于生藥 3.4 g。白花龍膽花水提物的制備,以蒸餾水作為提取劑,方法同上,最終濃縮得到干物質(zhì) 242 g,每克相當(dāng)于生藥 4.1 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小白鼠,普通級(jí),(21±0.3)g,由青海省地方病研究中心提供。

1.3 試劑與儀器

伊文思藍(lán)(青海省高原心臟病研究所提供),二甲苯,丙酮(分析純),生理鹽水,甲醇(色譜純)。龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品購自中國(guó)生物制品檢定所 (批號(hào): 110770-200510)。

CARY 300 B IO紫外-可見分光光度儀 (美國(guó)Varian公司),Sigma 3-18K離心機(jī) (德國(guó) sigma公司),ALC 110.4分析天平 (北京賽普利斯公司), Agilent 1200型高效液相色譜儀 (美國(guó)Agilent公司)

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 白花龍膽花水提物和乙醇提取物中的龍膽苦苷含量測(cè)定

色譜條件:Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm ×150 mm,5 mm)色譜柱,流動(dòng)相:甲醇一水 (含0.01%乙酸)體系,在 0～20 min內(nèi)由 20%甲醇等度洗脫,流速1.0 mL/min,柱溫 30℃,壓力 400 bar,參照相關(guān)文獻(xiàn)[3,8],選檢測(cè)波長(zhǎng) 270 nm,進(jìn)樣量 4 mL

對(duì)照品溶液制備:精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品,加甲醇制成0.23 mg/mL溶液,進(jìn)樣量依次為 0.46,0.92,1.84, 3.68,7.36 mg。

樣品溶液制備:精密稱取醇提物和水提物各0.2 g加甲醇分別定容至 25 mL容量瓶中。

2.2 小鼠毛細(xì)管通透性測(cè)定

取昆明種小白鼠共 70只,按照體重隨機(jī)分為 7組,每組 10只,雌雄各半,設(shè)空白對(duì)照組,白花龍膽花水提物低、中、高三個(gè)劑量組,白花龍膽花醇提物低、中、高三個(gè)劑量組,灌胃劑量分別為 3.0、1.5、0.8 g/kg,連續(xù)灌胃 (ig)給藥 14 d,于末次給藥前 24 h將小鼠腹部皮膚毛脫去,末次給藥后 1 h尾靜脈注射由生理鹽水配制的 0.5%的伊文思藍(lán) 0.1 mL/10 g,隨即于腹部去毛皮膚上滴二甲苯 0.03 mL,20～30 min后,脫頸椎致死,剝下腹部皮膚,將藍(lán)斑剪下,將每塊藍(lán)斑剪碎浸入盛有 10 mL丙酮-生理鹽水 (3: 7)的具塞試管內(nèi),存放于暗處,每日搖勻 3～4次,3 d后 2000 r/min離心 10 min,取上清液于 590 nm處測(cè)定吸光值,用丙酮-生理鹽水校零。

2.3 小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)

取昆明種小白鼠共 70只,按照體重隨機(jī)分為 7組,每組 10只,雌雄各半,設(shè)空白對(duì)照組,白花龍膽花水提物低、中、高三個(gè)劑量組,白花龍膽花醇提物低、中、高三個(gè)劑量組,灌胃劑量分別為 3、1.5、0.8 g/kg,連續(xù)灌胃 (ig.)給藥 14 d,末次給藥后 1 h,將二甲苯均勻涂抹于小鼠右側(cè)耳殼正反兩面,每只0.05 mL,1 h后脫頸椎處死,沿耳廓剪下兩耳,于同一部位用打孔器打下耳片(8～9 mm)稱重,以兩耳重量之差為腫脹度,利用下列公式求出腫脹率及腫脹抑制率。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析處理。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 白花龍膽花醇提物和水提物中龍膽苦苷的含量

經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度系列溶液分析測(cè)定,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y=1669.79X+150.70(線性范圍為:0.46～7.36 mg,r=0.9997),樣品測(cè)定后將峰面積帶入方程計(jì)算得到白花龍膽花醇提物中龍膽苦苷的含量為16.5 mg/g,水提物中龍膽苦苷的含量為 14.2 mg/g。

3.2 白花龍膽花醇提物和水提物對(duì)小鼠體重的影響

白花龍膽花醇提物和水提物各劑量組對(duì)小鼠體重的影響見表1

表 1 白花龍膽花醇提物和水提物對(duì)小鼠體重的影響(±s)Table 1 Effect of ethanol extracts and water extracts ofGentiana stram ineaMaxim’s flower on mice weight(±s)

表 1 白花龍膽花醇提物和水提物對(duì)小鼠體重的影響(±s)Table 1 Effect of ethanol extracts and water extracts ofGentiana stram ineaMaxim’s flower on mice weight(±s)

組別Group體重Weight(g)灌胃前Before ig.第一周Firstweek第二周Second week水提物高劑量組High dosage 21.0±1.60 22.6±1.99 23.8±2.80水提物中劑量組Middle dosage 20.7±1.65 21.5±2.38 23.4±3.43水提物低劑量組Low dosage 21.0±1.49 21.5±1.95 23.9±2.18醇提物高劑量組High dosage 21.1±1.36 21.4±1.78 24.4±2.01醇提物中劑量組Middle dosage 20.7±1.58 21.3±2.41 24.0±2.24醇提物低劑量組Low dosage 21.5±1.47 22.8±2.00 24.4±3.01空白對(duì)照組Nor mal control 21.1±1.52 21.9±2.18 23.9±3.00

由表 1可知,小鼠經(jīng)白花龍膽花的水提物和70%乙醇提取物灌胃后,與空白對(duì)照組比較,小鼠體重增長(zhǎng)無明顯差異。說明在本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的劑量下,白花龍膽花的水體物和乙醇提取物各劑量組對(duì)小鼠的體重沒有顯著的影響。

3.3 白花龍膽花對(duì)小鼠毛細(xì)血管通透性的影響。

白花龍膽花水提物和乙醇提取物對(duì)二甲苯所引起的小鼠腹部毛細(xì)管通透性增大的影響見表 2和表3。由表 2和表 3可知:白花龍膽花水提物和乙醇提取物各劑量組對(duì)二甲苯所致的毛細(xì)管通透性的增加有較好的抑制作用,且呈劑量效應(yīng)關(guān)系,高劑量組與低劑量組間有顯著差異,通過乙醇提取物和水提物的相互比較,可以看出本實(shí)驗(yàn)中醇提物的效果要稍好于水提物,但無統(tǒng)計(jì)意義。

表 2 白花龍膽花水提物對(duì)小鼠毛細(xì)管通透性的影響 (±s)Table 2 Effectofwater extractsofGentiana stram ineaMaxim’s flower on capillary penetrate in mice(±s)

表 2 白花龍膽花水提物對(duì)小鼠毛細(xì)管通透性的影響 (±s)Table 2 Effectofwater extractsofGentiana stram ineaMaxim’s flower on capillary penetrate in mice(±s)

注:與空白對(duì)照組比較△P<0.01,△△P<0.001;高劑量與低、中劑量組比較,▲P<0.01。Note:△P<0.01,△△P<0.001 vs Normal control group;▲P< 0.01 vs low and middle dosage group.

組別Group動(dòng)物數(shù)(只) Animals劑量(g/kg) Dose吸收度A水提取物高劑量組High dosage 10 3 0.1891±0.0144△△水提取物中劑量組Middle dosage 10 1.5 0.2300±0.0391△水提取物低劑量組Low dosage 10 0.8 0.2592±0.0502空白對(duì)照組Normal control 10 0 0.3015±0.0620▲

表 3 白花龍膽花乙醇提取物對(duì)小鼠毛細(xì)管通透性的影響(±s)Table 3 Effect of ethanol extracts ofGentiana stram ineaMaxim.’s flower on penetrate of capillary in mice(±s)

表 3 白花龍膽花乙醇提取物對(duì)小鼠毛細(xì)管通透性的影響(±s)Table 3 Effect of ethanol extracts ofGentiana stram ineaMaxim.’s flower on penetrate of capillary in mice(±s)

注:與空白對(duì)照組比較△P<0.01,△△P<0.001;高劑量與低、中劑量組比較,▲P<0.01。Note:△P<0.01,△△P<0.001 vs Normal control group;▲P< 0.01 vs low and middle dosage group.

組別Group動(dòng)物數(shù)(只) Animals劑量(g/kg) Dose吸收度A乙醇提取物高劑量組High dosage 10 3 0.1694±0.0504△△▲乙醇提取物中劑量組Middle dosage 10 1.5 0.2207±0.0443△乙醇提取物低劑量組Low dosage 10 0.8 0.2604±0.0564空白對(duì)照組Nor mal control 10 0 0.3015±0.0741

3.4 白花龍膽花對(duì)小鼠耳腫脹的抑制作用

白花龍膽花水提物和醇提物對(duì)二甲苯致小鼠急性耳腫脹實(shí)驗(yàn)的影響見表 4、表 5。

表 4 白花龍膽花水提物對(duì)小鼠耳腫脹的影響 (±s)Table 4 Effect ofwater extracts ofGentiana stram ineaMaxim.’s flower on ear swell in mice(±s)

表 4 白花龍膽花水提物對(duì)小鼠耳腫脹的影響 (±s)Table 4 Effect ofwater extracts ofGentiana stram ineaMaxim.’s flower on ear swell in mice(±s)

注:與空白對(duì)照組比較△P<0.01,△△P<0.001;高劑量與低、中劑量組比較,＊P<0.01,▲▲P<0.001Note:△P<0.01,△△P<0.001 vsNormal control group;※P<0.01,▲▲P<0.001vsmiddle and low dosage group

組別Group動(dòng)物數(shù)(只) Animal劑量(g/kg) Dose腫脹度Degree of swell抑制率(%) Bate of swell水提物高劑量組High dosage 10 3 0.4836±0.0961△△▲▲＊ 46.76水提物中劑量組Middle dosage 10 1.5 0.7525±0.0558△ 17.15水提物低劑量組Low dosage 10 0.8 0.8268±0.0693 8.968空白對(duì)照組Normal control 10 0 0.9082±0.0699

由表 4、表 5數(shù)據(jù)可知:白花龍膽花水提物和乙醇提取物對(duì)小鼠急性耳腫脹有明顯的抑制作用,并且呈顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系,其中,高劑量組的抑制率分別達(dá)到 46.67%和 55.88%。此外,高、中、低三個(gè)劑量組間也有顯著性差異,高劑量組和低、中劑量組間差異極顯著,通過比較,本實(shí)驗(yàn)中 70%乙醇提取物的效果也優(yōu)于水提物,但無統(tǒng)計(jì)意義。

表 5 白花龍膽花乙醇提取物對(duì)小鼠耳腫脹的影響(±s)Table 5 Effect of ethanol extracts ofGentiana stram ineaMaxim.’s flower on ear swell in mice(±s)

表 5 白花龍膽花乙醇提取物對(duì)小鼠耳腫脹的影響(±s)Table 5 Effect of ethanol extracts ofGentiana stram ineaMaxim.’s flower on ear swell in mice(±s)

注:與空白對(duì)照組比較△P<0.01,△△P<0.001;高劑量與低、中劑量組比較,＊P<0.01,▲▲P<0.001。Note:△P<0.01,△△P<0.001 vsNormal control group;＊P<0.01,▲▲P<0.001vsmiddle and low dosage group.

組別Group動(dòng)物數(shù)(只) Animal劑量(g/kg) Dose腫脹度Degree of swell抑制率(%) Bate of swell醇提物高劑量組High dosage 10 3 0.4007±0.1470△△▲▲＊ 55.88醇提物中劑量組Middle dosage 9 1.5 0.6580±0.1287△△ 27.54醇提物低劑量組Low dosage 10 0.8 0.7985±0.0821△ 12.07空白對(duì)照組Normal control 10 0 0.9082±0.0699

4 討論

毛細(xì)管通透性測(cè)定是解表類藥物抑制早期炎癥反應(yīng)的常用方法,其中腹腔染料滲出法,是較為常用、且效果較好的一種方法,染料伊文思藍(lán)可與血漿蛋白穩(wěn)固結(jié)合,當(dāng)致炎因子誘導(dǎo)毛細(xì)管通透性增加時(shí),在一定范圍,染料的漏出量可反映血漿蛋白量。小鼠耳腫脹法也是常用的炎癥研究方法。

現(xiàn)已從秦艽的根中提取出了龍膽苦苷、秦艽苷A、谷甾醇和揮發(fā)油類等多種成分,并發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、鎮(zhèn)痛、降壓、升血糖等作用[8],陳長(zhǎng)勛等[9]的研究表明,龍膽苦苷對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有良好的抗炎及鎮(zhèn)痛作用。本實(shí)驗(yàn)通過兩種炎癥模型,證明了白花龍膽的地上部分—花也有良好的抗炎療效,對(duì)二甲苯所致的小鼠急性耳腫脹和腹部毛細(xì)管通透性均有顯著的抑制作用,水提物和乙醇提取物都呈顯著的量效關(guān)系;并且通過比較可知,醇提物的效果要明顯優(yōu)于水提物;其次,經(jīng)過 HPLC法測(cè)定可知,白花龍膽花醇提物和水提物中龍膽苦苷的含量分別達(dá)到了16.5,14.2 mg/g,與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中醇提物效果好于水提物的結(jié)果一致,證明了龍膽苦苷的抗炎療效。目前白花龍膽的藥材來源主要以野生為主,中藥材以根入藥,過度采挖使得秦艽資源銳減,如果能將其地上部分花也加以有效利用,那對(duì)于白花龍膽資源的可持續(xù)利用有很大的意義。

1 Yang YC(楊永昌).TibetanMedicinal(藏藥志).People’s Publishing Company ofQinghai,1991.9-10.

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Research on Anti-inflammation Effects of Gentiana stram ineaMax im.’s Flower

YANG Fang1,2,WANG Hong-lun1,L IChun-ting1,2,SUO You-rui1＊1Northwest Institute of Plateau B iology,Chinese Academ y of Sciences,Xining 810001,China;2Graduate University of the Chinese Academ y of Sciences,Beijing 100049,China

To study anti-inflammation effectsofGentiana stram ineaMaxim.’s flower onmice lead by xylene,andwe determined gentiopicroside inGentiana stram ineaMax im.’s flower.We use the method ofmice acute ear swelling test and capillary penetrate of abdomen.The mice were randomly divided into seven groups according to theirweight,the nor mal control group,high,middle,low dosage group of water extracts and 70%ethanol extracts.After mouse were feed for 14 days.The s well of ear and absorption of serous albumen were deter mined.The results showed that no matter water extracts or 70%ethanol extracts,each dosage could obviously restrain the inflammation of mice,and take on prominent quantity and effect relation,and then,two methods all showed the effect ofwater extracts not as effective as 70%ethanol extracts.The result indicated thatGentiana stram ineaMaxim.’s flower have significant anti-inflammation effect.

Gentiana stram ineaMax im.’s Flower;Anti-inflammatory Effects

1001-6880(2010)02-0330-04

2008-06-27 接受日期:2008-11-06

中國(guó)科學(xué)院“西部之光”人才培養(yǎng)計(jì)劃

＊通訊作者 Tel:86-971-6143857;E-mail:yrsuo@nwipb.ac.cn

R285.5;Q946.91

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